蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

一、实验内容：

     将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液，用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过硫酸铵盐析进行分离（15%、30%‘45%饱和度的硫酸铵分别沉淀），得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS-PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。

二、实验过程：

1、蛋白质粗提液制备

溶液配制：0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液

（1）1000ml 0.1mol/l磷酸氢二钠：？g磷酸氢二钠溶于800ml蒸馏水中，定容至1L；

（2）250ml 0.1mol/l磷酸二氢钠： ？g磷酸二氢钠溶于200ml蒸馏水中，定容至250ml；

0ml（1）+190ml（2）混合即得0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液。

样品制备：取50头玉米象，用少许缓冲液洗去表面面粉，匀浆于1ml 0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液中，14000r/min离心15min，将上清转移至一新的离心管中作为蛋白质粗提液备用。

2、蛋白质浓度测定：

（1）溶液配制：

1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准溶液，5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；

考马斯亮蓝G-250蛋白试剂, 称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，滤纸过滤，避光保存。

（2）0～100µg/ml标准曲线测定：

取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2ml

以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=?。

（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2ml），取稀释液500µl与2.5ml考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500µl蒸馏水+2.5ml考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。

3、硫酸铵盐析的方法进行分离

4、SDS-PAGE

溶液配制：

100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）；

100ml 1.5M Tris-HCl,pH8.8：18.15gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl调pH值至8.8，定容至100ml蒸馏水中；

100ml 0.5M Tris-HCl,pH6.8：6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中；

10ml上样缓冲液：0.5ml ddH2O + 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS+77.1mg DTT+1ml 0.05（W/V）溴酚蓝；

600ml 5×电泳缓冲液：9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS蒸馏水溶解定容至600ml；

1ml 10%过硫酸铵溶液（现用现配）：0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。

1000ml固定液：取908ml50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀；

500ml染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加500ml固定液溶解，过滤后避光保存；

1000ml脱色液：取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸馏水定容至1000ml。

凝胶制备：

7.5%分离胶（20ml）

ddH2O             11.87ml

30% arc/bis          5ml

1.5MpH8.8Tris-HCl    2.5ml

10%SDS             0.2ml

10%的AP            0.1ml

TEMED               10µl

4%浓缩胶（10ml）

ddH2O             6ml

30% arc/bis          1.3ml

0.5MpH6.8Tris-HCl    2.5ml

10%SDS             0.1ml

10%的AP            0.05ml

TEMED               5µl

灌胶：将电泳板组装好，先灌分离胶至2/3处，水封，分离胶凝固后，吸去水，灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。

样品准备：

分子量Marker、100µg粗提液、100µg分离组分与样品缓冲液混合，煮沸3min，作为电泳样品上样。

电泳装置安装：安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。

上样：将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序。

电泳：接好电泳仪，通电，先恒压80V电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时，加大电压至120V继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，结束电泳。

剥胶：拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝胶留在长板上，在右下角切角作标记，用固定液冲下凝胶。

固定：将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定1h；

染色：倒去固定液，加入染色液，染色1h，

脱色：倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带。

凝胶拍照。

三、实验结果

1、各组分蛋白浓度

2、电泳结果

四、分析讨论

分离效果如何？实验设计如何改进？