临床化学中的干扰实验核准的指导原则

核准的指导原则——第二版

1. 概览

本文件用于以下两个目的：

1) 通过提供科学有效的实验设计，指定待检测的相关干扰物质及浓度和阐明正确的数据分析与解读，来协助制造商以及其他实验室检测方法研发人员来确定检测方法对干扰物质的敏感程度。这样可以评估出潜在的干扰危险物，也可以向用户提供有意义的干扰声明；以及

2) 通过定义系统性研究策略，确定数据收集和分析要求以及促进实验室用户和制造商之间更广泛的合作，来协助临床实验室研究由于干扰物质存在而产生的异常结果。这样，新的干扰物可以被鉴别、揭示并最终消除掉。

本指导原则用于体外诊断医疗设备制造商以及临床实验室。

制造商以及其他实验室检测方法研发人员有责任有责任确定由于干扰物质引起的误差而对其检测方法的分析性能造成的影响以及对病人的潜在伤害。制造商被要求向使用其系统的用户提供关于干扰敏感度的有关信息。备注：本文件中“制造商”系指研发用于临床实验室的检测方法的任何个人以及企业。

临床实验室有责任确保其检测方法的特异性能够满足其客户的需求。实验室同样应该研究异常结果，鉴别干扰物质并向提供分析系统的制造商提供客观的反馈。

2. 介绍

2.1 检测方法

任何检测方法。不论是定性的还是定量的，都可能受到干扰。本文件广泛适用于各个检测方法以及分析仪器。有可能需要做出适当修改，以适应不同流程的特点。附录A中讨论了两个具体的方法原则（分离技术以及免疫化学检测方法）。

2.1.1 标本类型

使用本指导原则可以评估使用血清、血浆、全血、脑脊髓液、尿液以及其他大多数体液的检测方法中的干扰。

2.1.2 干扰物质

潜在的干扰物质可能来源于以下内源性以及外源性途径：

●病理情况下产生的代谢物，如糖尿病、多发性骨髓瘤、瘀胆型肝炎等等；

●治疗过程中引入的物质，如药物、肠胃外营养、血浆容量扩张剂、抗凝剂等等；

●病人摄入的物质，如酒精、药物滥用、营养添加物、各种食物与饮料等等；

●标本准备过程中添加的物质，如抗凝剂、防腐剂、稳定剂等等；

●标本处理过程中无意引入的污染物，如手霜、含粉手套、血清分离管，收集管胶塞等等；

●标本自身的基质，如不同于理想新鲜标本的理化性质。

2.2 概念与科学原则

2.2.1 干扰对不精确度的影响

不准确度（总分析误差）共由三部分组成：不精密度、方法特异性偏差以及标本特异性偏差。检测方法评价通常只评价前两项。标本特异性偏差（即干扰），通常被视为特定样本的问题，而非过程的可量化的特征。从评估的观点来看，干扰敏感性可引起系统误差与随机误差，两者都可以作为不准确性（总分析误差）的组成部分进行分析学上的量化。

●对于给定的病人群体，标本中干扰物质的平均浓度会引起系统性偏差，其会被涵盖于偏差评估中。相对于均值的个体偏差，会在与另一更精确的检测过程的比对中，构成总随机误差的一部分。对于部分检测而言，随机干扰效应，会超越不精密度，成为随机误差的主要来源。

●对于病人个体而言，干扰物质引起的误差取决于其在病人标本中的浓度。干扰物浓度改变，偏差度随之改变。偏差引起的结果变化，可能被错误的解读为病人体征的变化。

2.2.2 临床相关性

在临床医学中，干扰必须从临床的角度评估。临床相关性决定了一个分析效应究竟是否应该考虑为干扰。待测物的形式和浓度基准必须被清晰的定义。

矛盾的是，某些检测过程可能反映出待测物的真实浓度，但却并不一定是临床相关值。比如火焰光度法和间接电势测量法能正确测量出血浆中钠的含量，不论脂浓度为多少。然而，如果脂浓度较高，这些方法可能会将电解质平衡正常的病人，检测为低钠血症。在这个例子中，直接电势测量法可以准确报告正常钠水平，因为其是对血浆水相中的钠活性做出反应，而钠活性正是机体调节的。因此，从临床的角度来看，对标本中总钠的过高估计是合适的。在尝试解读干扰试验结果之前定义临床相关浓度是很重要的。

2.2.3 预分析效应

分析前待分析物的变化或者是浓度的改变，通常被定义为预分析效应。尽管这种效应可能会“干扰”实验室结果的临床用途，其并不能算分析干扰。除非明确说明，否则检测过程应该同时检测标本中所有的待分析物质，不论其来源为何。

常见的预分析效应有：

●体内（生理学）药物效应，受药物影响的循环激素浓度；

●待分析物的化学变化，如水解、氧化、光解等等；

●待分析物的物理变化，如酶的变性；

●标本的挥发或稀释；以及

●附加待分析物的污染（比如来自静脉注射的盐，与凝血块接触时间延长导致的葡萄糖损失或者溶血带来的红细胞内成分。

2.2.4 相对干扰

干扰的计算是相对于对照中的待分析物的测量而言的。在某些情况下，对照组中可能会含有一定量的内源性干扰物质（对照组中病人群体的物质浓度的平均值）。常见的例子有胆红素、血红蛋白、蛋白质和脂类。

有些检测方法会按照干扰物的平均浓度进行抵消或修正，从而减小针对病人群体检测的干扰效应。典型的方法有样本预处理、空白化、血清基质校正以及数学校正。当病人标本中的干扰物浓度大于或者小于病人群体平均浓度时，误差会被引入。

比如，某个被蛋白质干扰的药物检测方法，其偏差为0.05μmol/L每1.0g/dL蛋白质。因为血清标本中蛋白质平均浓度为7.0g/dL，其相对于无蛋白对照组的平均偏差为0.35μmol/L。如果用上述方法之一将偏差消除，针对个体标本的蛋白质效应将是相对于平均蛋白浓度7.0g/dL条件下的0.05μmol/L每1g/dL蛋白浓度升高/降低。含7.5g/dL蛋白的标本的偏差将变为+0.025μmol/L，而非+0.4μmol/L。除非样本里的蛋白含量刚好是7.0g/dL，否则每份病人标本的药物检测结果将呈现较小的正/负偏差，其取决于真实的蛋白质浓度。

以下信息对例子进行了扩展。假设假定药物的真实浓度是25.0μmol/L，检测方法受蛋白影响的程度如上所述。注意在偏差校正过的系统中，蛋白质引起的误差范围仅有+0.20μmol/L，而在偏差未校正过的系统中，蛋白质引起误差范围为+0.15μmol/L到+0.55μmol/L。

2.2.5 干扰机制

分析过程可能会被干扰物质通过多个途径干扰。

●化学干扰。干扰物可能通过与试剂竞争或者阻碍指示剂的反应来压制反应。其也可能通过络合或者沉淀改变待分析物的形态。

●检测干扰。干扰物可能有与分析物相似的，能够被检测或者测量到的性质，如荧光、颜色、光散射、洗脱位点或电极响应等。

●物理干扰。干扰物可能会改变标本基质的物理性质，比如粘度、表面张力、浊度或离子强度，从而引起待分析物质浓度明显的变化。

●酶抑制。干扰物可能会通过分离激活金属离子，与催化位点结合或者氧化必需的巯基等等来改变酶的活性（待分析物或者试剂）。在基于酶反应等检测方法中，干扰物也可能与酶竞争某个关键基质。比如腺苷酸激酶与肌酸激酶竞争结合ADP，因此在某些检测中会被错误的检测为肌酸激酶。

●非特异性。干扰物可能会与待分析物有相同的反应。尽管干扰物有着不同的非特异性机理，但其实践效应对于实验室是一样的。一些常见的例子：碱性苦味酸肌酸酐检测过程酮酸的干扰；重氮胆红素检测中硫酸吲哚酚的干扰。

●交叉反应性。在免疫化学检测过程中，与某个抗原结构相似的干扰物可能会与抗体发生“交叉反应”。这是非特异性的一种形式。比如，咖啡因在某些茶碱检测过程中会被检测到。交叉反应性的程度被视为对于免疫化学检测特异性的考核，但对于干扰敏感程度的考核并不是一个有用的指标。

●水置换。非水性物质（蛋白、脂类）通过置换水相等离子体，影响基于活性检测的测量体系。如果打算检测等离子水相中的待分析物浓度时，这些效应可以不用考虑为干扰。

3 标准预防措施。

因为通常不可能知道哪种分离物或者标本可能会有传染性，所有的病人和实验室标本都要被看做是传染性的并依照“标准预防措施”进行处理。标准预防措施是结合了《通用预防措施与人体物质分离》的主要特征的指导措施。标准预防措施涵盖了所有传染性物质的传播，因而比仅仅用于血液病原体传播的通用预防措施更加广泛。标准预防措施与通用预防措施指导原则均可在美国疾病控制与预防中心下载与索取。如需更具体的关于防止实验室设备与材料中所有传染性物质的传播的预防措施以及关于暴露于传染性疾病的风险管理的推荐方案，请参考CSLIM29文件最新版本——Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections。

4 定义

准确度——测量结果和测量物的真实值的吻合度。备注：参考测量物的定义。

α误差/I型错误——错误拒绝空白假设（物质不发生干扰）的可能性。备注：参考置信水平的定义。

对立假设——在干扰试验中，在指定的幂下检测，物质引起的干扰大于指定的情况。备注：参考：幂和β误差的定义。

待分析物——作为可检测物质存在的组分。备注1：在物质类型“24小时尿液中的蛋白质量”中，蛋白质是待分析物。在“血浆中葡萄糖含量”中，葡萄糖是待分析物。备注2：待分析物是对病人有意义的特定组分。

分析特异性——检测过程只检出检测物的能力。

异常结果——参见差异结果的定义。

β误差/II型错误——错误拒绝对立假设（物质发生干扰）的可能性。备注：参见幂的定义。

偏差——检测结果预期值与可接受的参考值之间的差异。备注：在本文件中，节7中“可接受的参考值”是指同一检测方法中在没有干扰存在的情况下获得的结果。在节8中是指对比性检测方法的结果。

临床显著性——在评估检测方法的背景下，误差改变内科医生对于病人进行诊断、治疗或者管理的潜在可能性的重要性。

对比性检测方法——在评估检测方法时，作为确定标本中待分析物质真实浓度的较精确的检测方法。

置信水平——与置信区间关联的可能性的数值（1-α）。备注1：可能性通常以百分比表示：100（1-α）%；备注2：参见α误差的定义。

差异结果/异常结果/假结果——与从同一标本采集到的另一结果，从另一检测系统获得的结果或者与确证的临床诊断的临床显著度不一致的结果。

药物效应——常用于描述药物对于某物质体内浓度的生理学影响，与之对照的是在分析过程中的体外效应

内源性干扰物——标本中生理产生的，能够对另一物质检测过程产生影响的物质（如胆红素或血红蛋白）。

外源性干扰物——来源于体外的，能够对标本中另一待分析物检测过程产生干扰的物质（如药物或其代谢物，标本防腐剂或者标本污染物）。

析因实验——将所有可能的影响因素组合考察完全的实验设计。这些组合由两个或多个因素组成，每个因素考察两个或多个水平。这样反应性（差异效应）以及主要效应都可以被评估出来。

不精密度——特定条件下获得的的检测结果的散布。备注：常表达为“标准差”或者“变异系数”。

不准确度——测量值与真实值之间的数值差异。备注1：参见准确度的定义；备注2：参见总分析误差的定义。

干扰——在临床化学中，由于另一组分的影响或者标本的性质导致的待分析物检测浓度的临床显著差异的原因。备注：其可能由于检测系统的非特异性、指示剂反应的阻遏、待分析物的阻遏或者一些其它标本依赖性偏差。

干扰声明——描述检测方法中某物质可能造成影响的说明。备注：常见于产品的“方法局限性”条目下。

干扰标准——有改变内科医生对病人进行诊断、治疗或管理的潜在可能的，待分析物浓度与真实值之间的偏差的最大容许干扰度。

干扰筛选——在分析系统的评估中，用于鉴别可能存在干扰的常见物质的一系列加入高浓度干扰物的实验。

干扰敏感度——检测方法针对来自于其它组分或标本性质引起的干扰的误差的敏感度。

干扰基质/干扰物——本术语按照VIM的模式定义为“影响物质”，即不是检测物的却能影响检测结果的物质。

基质——物质系统中，除待分析物外的所有组分。

基质效应——标本性质对于特定检测过程中检测值的影响。备注：粘度、表面张力、浊度、离子强度以及pH是常见的基质效应产生因素。

待测物——针对检测的特定的量值。备注1：本定义涵盖所有量值，常用的术语“待分析物”则指测量过程涉及到的具体的物质（即，待测物描述了引发检测结果的“物”【如，酶活性】，待分析物描述了对病人有意义的特定的组分）；备注2：参见待分析物的定义。

方法特异性偏差——由于检测方法的特征与特性引起的系统性误差。

非特异性——在检测系统中，非目的待检测物的物质的反应性。备注：非特异性常由抗体、酶、离子载体或者试剂结合、络合或与非待检测物质的反应引起的。

空白假设——在干扰试验中，在特定的置信水平下检测，物质不会引起干扰的情况。

单侧检验——当对立假设指出干扰效应的趋向时（正向干扰或负向干扰）用于显著性的统计学检验

幂——不

精密度——规定条件下的获得的实验结果的接近度。备注：精密度往往不用数值表示，但常以不精密度来定量表达——一组检测结果的标准差（SD）或变异系数（CV）。

随机样本依赖性干扰——在病人标本群中不同浓度干扰物引发的变化。备注：随机干扰被量化为病人个体标本的偏差的SD；备注2：其是回归分析中Sy,x的组成部分，也是总随机误差的一个主要构成因素。

重复性——在相同实验条件下针对相同检测物获得的结果的接近度。备注：有时又被称为分析内精密度。

样本——从系统中分离出的一个或多个部分，以提供关于系统的信息。通常作为决定系统或者其产物的参考基础。

特异性——检测方法在存在干扰环境或者影响物质的前提下，正确识别或者测量待测物的能力。备注1：在质量控制的背景中，当特殊情况引起的变异真实存在的情况下，特殊质控体系发现其存在的可能性；1-错误报警可能性，即质控体系数据点超出了容许范围，但检测系统未发现任何误差的情况；备注2：在免疫学中，特异性是抗血清的质量标准，定义了与特定抗原的反应性。特异性的缺乏是由于交叉反应的引入和/或干扰物质的存在，因为交叉反应物质会和待分析物竞争结合抗体识别位点。

标本（病人）——用于检查、研究或者分析一个或多个量值或特征来确定整体特征的体液分离物或者组织。

标本基质——待分析物存在的环境；备注：临床基质包括血清、血浆、尿液、脑脊液以及其他体液。

标本特异性偏差——由于标本特征或性质引起的测量值与真值之间的偏差，与检测方法的特征形成对照（比如校准、试剂不稳定）；备注：其是由单个标本表现出的影响效应。

假结果——参见异常结果的定义。

统计显著性——基于特定的幂与置信水平的，一个事件不是偶然发生的可能性的重要度。

治疗浓度——药物能够有效产生需要的临床效果的浓度。

总分析误差——由特定组分构成，并被量化为置信水平90%或95%下的置信区间。备注1：与“不准确度”的概念相同；备注2：用于估计VIM定义的最大可能性误差：测量值减去真值（或可接受的参考值）；备注3：由检测与参考检测方法的检测浓度差异评估而来。例如：检测和参考检测方法的差异的97.2%落在了±4mmol/L；因此实现了95%的总分析误差的目标。备注3：参见不准确度的定义。

毒性浓度——药物或者其他物质对病人造成伤害的浓度。

真实度——从数量较大的一系列测试结果中获得的平均值与可接受参考值的吻合度。备注：真实度的考察通常表达为偏差。

双侧检验——当对立假设不能指出干扰效应的方向（正向干扰或负向干扰）时所使用的显著性统计学检验。

I型错误——对空白假设的错误拒绝。备注：参见α误差的定义。

II型错误——对对立假设的错误拒绝。备注：参见β误差的定义。

验证——通过提供客观证据，确认到达了预期用途或应用的要求。备注1：WHO定义验证的定义如下：提供流程、过程、系统、设备或方法达到了预期要求并满足预期结果的行为或过程。备注2：验证的组成部分包括质量控制、水平测试、雇员能力验证、设备校准以及针对临床发现的校正。

检定——通过提供客观证据，确认达到了特定的要求。备注：在检测系统应用于病人检测前完成的，用于决定或确定检测性能特征的一次过程。

室内精密度——参见重复性的定义。

5 干扰试验的决定标准

在建立一项评估实验之前，必须先确定可接受性标准，以确保客观性。评估者必须决定什么程度的分析效应会对检测结果的临床使用造成干扰。因为针对干扰试验的恰当的实验设计取决于怎样程度的偏差会被考虑为临床显著的。

在建立可接受性标准时，必须区分临床显著性和统计显著性。两者在建立可用的标准时都很重要。

5.1 临床可接受性标准

对于干扰引起的误差的可容许程度显然取决于检测结果的医学用途。对于一些待分析物，准确度要求（总可允许误差）已有建议。所引文献代表了一些例子。对于其他待分析物，准确度标准可以通过下述任何一种方法来建立。可通过将准确度（总可容许误差）分解为偏差、不精密度以及干扰部分，来建立可允许干扰的值。总可允许干扰误差的部分便是去除掉偏差和不精密度后，也包括待分析物的生理学变异部分（方差），残余的误差。

5.1.1 基于生理学变异的标准

一种建立准确度要求的方法是基于待分析物的生理学变异。原则上，误差界限应设为此种分析变异性相对于待分析物在个体和人群中的固有变异性的最小值（取决于待分析物的临床应用）。此方法对于生理学控制的待分析物效果较好。

5.1.2 来自于临床经验的标准

临床专家的共识经常用于建立准确度要求。从他们的临床经验中，从业者可参考多大程度的误差会影响他们的诊断或者治疗决定。合理的准确度和干扰标准可以由相关临床的典型例子中建立起来。

5.1.3 基于分析变异的标准

干扰标准同样可以源于检测方法的总的长期的不精密度。如果，病人样本中干扰物水平很高，而相对于分析变异来说，其影响很低，则由于干扰物引起的总误差的升高，不太会显著影响临床决定，该物质不应被视为干扰物。

5.2 统计显著性与幂

在作出一种物质是否有干扰之前，评估者必须确保结果是分析学显著的。需要有充分的重复实验，这样检测就是在充分的幂下进行，来检测临床显著干扰，以及在充分的置信水平下，来识别临床非重要偏差的存在。

本指导原则采用的统计学手段称为“假设检测”。评估者预先确定病人检测结果中多大的偏差会是临床显著的。此可允许偏差的量会被作为干扰界值，或者干扰尺度。之后检测不含干扰的空白假设（偏差未超过界限）与含干扰的对照假设（偏差超过界限）。这些统计学检测基于预先设定的统计学幂和置信水平。参考7.1至7.1.6决定基于幂和置信水平的样本规模。

5.3 待分析物检测浓度

干扰要在待分析物的两个医学决定浓度下评估。若出于成本或其他实践考虑，预实验只能在一个浓度下，要留意可能会遗漏在另一个待分析物浓度下的临床显著干扰。

常见待分析物的推荐测试浓度列于附件B中。使用了可引用的出版的关键或决定值。缺乏医学共识值时，待分析物的浓度有些是假定的，但干扰声明是重要的目标。在临床应用的指导下，绝大多数情况下，选择了参考范围的上限或者下线以及代谢浓度。

5.4 潜在干扰物质

对于复杂的检测方法的特征，要从列出有潜在干扰可能的物质的列表开始。

●常见的标本不正常，如溶血、黄疸和高血脂。

●常见的处方药与非处方药。

●不正常的生化代谢物。

●在检验所涉及的病人群体中，最常开处方的药物。

●由于其化学或物理性质，可能会对检测造成干扰的药物，包括代谢物。

●据报道会对相似检测方法造成影响的物质。参见Young等人与Trying和Roos的文字调查。

●标本添加剂，如抗凝剂（肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐等等）以及防腐剂（NaF、碘乙酸、HCl等等）。

●在收集与处理过程中，可能会与标本接触的物质，比如血清分离设备、标本收集容器和相应的胶塞、导管、导管冲洗液、皮肤消毒剂、手霜、去污剂、含粉手套等等。

●已知会影响特定检测的膳食物质（咖啡因、β胡萝卜素、罂粟子等等）。

列表可能会涵盖广泛。下列物质可认为遗漏重要干扰物的风险很小。确保当潜在干扰物被排除时，其理论根据被记录下来。

●与列表中的物质有必需的特征组成和结构的物质。然而，基于抗体、酶或者其他特异性结合蛋白的亲和力，所有的结构类似物都应该检测一遍。

●基于同样的科学规律，已经被展示过，不会对检测造成干扰的物质。

●基于对化学性质的专业知识，不太可能造成干扰的化合物。

●基于检测的了解，处方剂量很小，不会引起干扰的药物。

●由于清除或代谢过快，检测时不会处于干扰浓度的药物。

5.5 干扰试验浓度

为确定在“最坏情况”下某物质是否会干扰，综合的干扰筛选需要在实验室可能考察到的病人标本中观察到的最大浓度条件下进行。以下提供的指导用于协助选择合适的检测浓度。

由于正向与负向干扰效应可能由于不同的机制引起（比如血红蛋白除在可见光谱中有强烈的吸收作用外，还有催化活性）每个物质都需在两个不同浓度下检测，以避免在检测浓度下相抵触的效应互相抵消的可能性。参见7.3节关于能够同时检测待分析物与干扰物多个浓度的备选实验流程。

●药物与代谢物

对于血清、血浆以及全血样本，至少按照报道的药物治疗剂量的最高值（急性峰值浓度）或者最高的预期值检测三次以上。如果预期的血液中浓度未知，可假设治疗剂量分散于5升血液中，然后按此浓度检测至少三次。参见附件C中对于多数常见药物的推荐测试浓度的列表。

对于尿液，确定24小时内排出的最大量，然后按每升尿液中含有此量来检测至少三次。如果尿排泄量未知，则按照每升尿液中含最大治疗剂量来检测至少三次。

●内源性物质

鉴别出在适用病人群体中预期的最高浓度，然后按此浓度检测。参见附件D中检测部分内源性组分的推荐浓度的列表。

●抗凝剂与防腐剂

对于血清、血浆以及全血，对推荐的添加浓度检测至少五次，以模拟“缺量”（即未足量的血液收集管）。

对于尿液，对推荐用于24小时收集的尿液量的防腐剂的量检测五次。

●膳食物质

对于血清、血浆以及全血、对最大预期浓度检测至少三次。

对于尿液，对24小时内每升尿液的排出量检测至少五次。

●标本收集与处理设备

将设备与混合标本接触24小时以提取潜在干扰物质。体积应以实际应用中的“最坏情况”为准。谨防标本挥发或者不稳定待分析物的损失，并设置合适的对照标本，其应与检测标本一致，除了未与设备接触之外，处理方法应完全相同。

6 质量保证与安全

在实施干扰试验之前，核对以下内容：

●设备按照制造商的说明经过校准和维护；

●分析系统受控且按照预期性能工作；

●所有操作人员经过合格的培训；

●严格按照实验室安全流程操作。

文件记录按照上述要求执行。

6.1 培训与熟练

执行评估的人员必须熟悉相关设备的操作，并接受了检测方法的培训。设备必须正确的维护与修理，并按照制造商的说明进行。

6.2 精密度检验

精密度须与制造商性能特征一致。需要进行针对可重复性的评估，以确定节7中实验所需要的重复次数。如果可重复性未知，需要进行最新版EP5中叙述的预实验。

6.3 真实性检验

检测方法的偏差需经过合适的回收实验或者方法比较来确定。尽管恒定的偏差不会影响干扰性研究，部分性偏差会导致在各种浓度下，干扰被低估或者高估。

6.4 串行评估

检测结果可能会被前一样本的串行而影响。如果串行发生，则需要设计实验来区分串行效应与干扰效应。

6.5 质量控制

在检测开始前，分析系统要处于可稳定运行状态。在检测期间，要通过质量控制流程来监控性能指标。按照制造商的说明执行并参考最新版C24文件。

6.6 安全与废物处理

对于关于安全、正确的处理以及丢弃实验室化学品的详细信息，参考制造商的标签以及物质安全数据手册。此信息可从供应商处获得。

7 干扰特性评估

本节提供了用于评价检测方法对干扰物质敏感度的实验流程。尽管实验室希望能够将此流程作为对新流程的彻底的合格评价，但其主要设计用于制造商评价其检测。

有两种基本方法可用于评估检测方法对干扰的敏感度。每种均有优点以及固有，但其提供了互相补充的信息，应该一同使用。这两种方法是：

●评估加入目的标本中的潜在干扰物质的效应（参见7.1至7.3节）；

●通过与高特异性对比检测方法对比，来评估个体偏差、代表性病人样本（参见8.2节）。

7.1 干扰筛查

向混合样本中加入潜在干扰物质并评估与相同混合样本的对照之间的偏差的方法称为“配对差异检测”。评估多种潜在干扰物质的高浓度以模拟“最坏情况”的方法称为“干扰筛查”。如果未观察到临床显著效应，则被该物质引发的偏差可认为不重要，不需做进一步的检测。

显示出临床显著效应的物质被考虑为干扰物，需要进一步评估以确定干扰物浓度以及干扰程度之间的关系。

没有任何干扰试验策略能够甄别出所有的干扰物。有些干扰物（比如药物代谢物）可能在干扰筛查中未被检出；有些物质可能会被错误的划为干扰物（比如不代表天然形态的物质的结构）。干扰筛查提供了标准化的评估，补足了针对真实病人标本的研究。

干扰实验存在两点局限：

●添加到混合血清中的化合物性质可能与天然存在于体内的化合物的性质不同

●不同的干扰效应可能会在检测的干扰物以及待分析物浓度下相互抵偿。基于此原因，血红蛋白应总是与不止一个浓度的胆红素一起评估干扰。

来自于可信的病人标本的数据可用于和来自于“异常”标本的数据结合，以帮助查明“”。

附件B中给出了许多常见待分析物的推荐检测浓度。指出了每种潜在干扰物质都应在两个待分析物浓度下检测。如果不可实现，附件B检测的优先浓度。仔细评估反应的可能性，并在两种待分析物浓度下检测怀疑的物质。

7.1.1 实验设计

待测标本群与对照群都应在同一次检测中，采用合适的重复数目，用相同的方法检测。

需要足够的重复数，来使错误拒绝没有干扰的空白假设的可能性（在统计学中，I型错误）或者错误拒绝有干扰的对立假设的可能性（II型错误）降到最低。

标本需要被重复的数量取决于以下四个因素：

●待分析物检测结果被认为临床显著的最小差异的程度；

●空白假设检测的置信水平；

●对立假设检测的幂；

●检测方法的可重复性。

7.1.2 实验物品

用于干扰试验的实验溶液的准备在附件G中提供。

7.1.2.1 基准标本组

按下列方法准备基准混合样本：

1） 获得来自健康的未服用药物的个体的适当类型（血清、尿液等等）的新鲜标本。混合样本应该反映出可以吻合目的待分析物的标本基质。

2） 如果新鲜标本无法获取，谨慎使用冷冻或者冻干的标本。经处理的对照液体中可能含有防腐剂和稳定剂，也包含不真实的待分析物组合，可能会得出与真实人血清不同的干扰效应。评估者有责任验证测试物质正确的模拟了新鲜临床标本。

3） 考虑检测方法的样本需求量、需要检测的物质的数量以及重复数要求，来计算所需基准混合样本的体积。

4） 确定基准混合样本中待分析物的浓度，并使用合适的纯品物质来调节基准混合样本至待分析物的医学决定浓度。避免一起引入其他物质。参见附件B中推荐的待分析物检测浓度。

7.1.2.2 储存液

按照下面说明为每种潜在干扰物准备储存液：

1）获得潜在干扰物的合适的纯品形态，或者最接近物质循环形态的形态。如果需要药品级的准备，记住其可能会含有赋形剂、防腐剂、杀细菌剂、杀真菌剂、抗氧化剂、染色剂、调味剂、金属氧化物、反离子和过滤物，任何一种都可能是观察到的效应的真实起因。

2）选择检测物质能够充分溶解的溶剂。参见《化学与物理手册》或者Merck索引来获得检测物质在这些溶剂中的溶解度。确定溶剂在评估中不会在检测方法中引起干扰。下面按常用顺序列出了可能的溶剂。

●试剂级纯水（参见C3中的细节信息）

●稀释的HCl或NaOH

●乙醇或甲醇

●二甲基亚砜（DMSO）

●其他有机溶剂

3）尽可能小程度的稀释样本基质，最好不高于5%，可通过制备至少20倍于预期检测浓度的浓缩储存液来实现。

4）有机溶剂需要特殊考虑。易挥发溶剂要防止挥发。储存液需要制备为最高工作浓度。许多有机溶剂在水中溶解度很低或可能通过影响试剂或者反应本身来引入假象。因氯仿在水中的低溶解度，其在血清中至少要稀释100倍。乙醇浓度高于1%到2%会使抗体变性。

详细记录储存液的准备。备注：在某些情况下，干扰可能由于内源性物质（CO2、H+[pH]或者蛋白）浓度降低而升高。为评估这一效应，基准标本组中潜在干扰物的浓度需要降低同时维持待分析物的浓度，以及对基质的最小的扰动。对照由基准标本组制备，要考虑任何的稀释或者物质添加。使用的方法应取决于待分析物和干扰物的天然属性并且必须被评估者验证。

7.1.2.3 对照标本组

制备对照混合样本应与检测混合样本在各方面都相同，除了用相同体积的溶剂代替制备检测混合样本时使用的检测干扰物。

1） 如果检测物质出现在对照混合血清中，使用合适的分析检测方法来确定其浓度。

2） 如果与基准标本组对照，对照混合样本中出现了非预期的明显的待分析物浓度，则考虑溶剂作为潜在的干扰物。

7.1.3 重复要求

满足所需置信以及幂的重复数要求取决于检测的统计学假设。

●双侧检验用于对立假设不能指出干扰的方向（正向或者负向）时，比如肌酸酐浓度为1.0mg/dL时±0.2mg/dL的偏差。

●单侧检验用于对立假设包含干扰方向（正向或者负向）时，比如肌酸酐浓度为1.0mg/dL时α-酮丁酸引起+0.2mg/dL的偏差。

7.1.3.1 双侧检验

对于双侧检验，可合理的假设检测误差的正常分布，对所需重复数的较好的估计可用下列公式计算：

（1）

其中：

z1-α/2是对双侧检验的响应置信水平100（1-α）的标准正态分布的百分比；

z1-β是响应幂100（1-β）的标准正态分布的百分比；

s是检测方法的可重复性标准差

dmax是待分析物检测浓度下的最大允许干扰度。

7.1.3.2 单侧检验

对于单侧检验，将公式中的替换z1-α/2为z1-α。

其中：z1-α是对单侧检验的响应置信水平100（1-α）的标准正态分布的百分比

7.1.3.3 z值

方便起见，对于常用的置信水平和幂水平的z值如下所示

表1 常用置信水平和幂的百分数

比如，评估者需要检测±1.5mg/dL作为可接受的干扰程度，置于95%置信水平（α=0.05）以及95%幂（β=0.05）下的效应。要求双侧检验。可重复性为1.0mg/dL。计算需要的重复数，将值代入公式。

（2）

因重复数必须是整数，数目需要留整，本例中为12。这是每个标本所需的重复数目。

7.1.3.4 重复数目

在95%置信和幂下检测各种干扰效应所需的重复数目列于下面。方便起见，干扰标准表达为表2中的可重复性（分析内）标准差的倍数（dmax/s）。

表2 在95%置信和幂下检测干扰效应所需的重复数目

7.1.3.5 重复的效应

一个例子总结出了合适的重复数目的重要性。内科医生将血清中肌酸酐的微小改变解读为潜在的肾脏排斥的指征。有时小如0.2mg/dL的改变都可能引起关注。然而实验室人员了解多种生化代谢物和药物都会干扰碱性苦味酸肌酸酐检测。

在一种情况下，一个近期肾脏受体者显示出了从1.0到1.2mg/dL的可重复的变化。内科医生想知道是否是头孢类抗生素引起的。

在1mg/dL的肌酸酐浓度下，可重复性标准差为0.075mg/dL。实验室设定0.1mg/dL为显著干扰。在合适的重复数目下，不精密度的影响可以减少，0.1mg/dL的可能的干扰就可以测出。

首先，将不精密度表达为可重复性标准差的倍数（dmax/s）：0.1mg/dL/0.075mg/dL=1.33

然后，取整为1.3，使用7.1.3.4节中的表2来确定所需的重复数目。表中显示在95%置信与幂下检测此程度的效应要求对照与检测各做16个重复。

如果可接受的干扰更大，比如0.2mg/dL（dmax/s=2.7），则想要在同等置信水平下的重复数会更少。表中显示此情况只需对照和检测各重复4个，而非16个。

7.1.4 实验流程

配对差异检测的步骤如下：

1） 确定合适的待分析物浓度

2） 建立“临床显著”差异的标准（dmax）。

3） 确定每个混合样本所需的重复数目（n）。参见7.1.3.4确定n的值。

4） 准备临床标本的基准标本组（参见7.1.2.1节）。

5） 准备待检测物质的20x储存液（参见7.1.2.2节）。

备注：如果还有另一浓度，根据步骤6和8调整。

6） 抽取目的体积的1/20的储存液至容量瓶中。此为“检测”标本组。例子：将0.5mL的20x储存液转移至10mL容量瓶中。

7） 用基准标本组定容。混匀。

8） 抽取目的体积的1/20的溶剂至另一容量瓶中。此为“对照”标本组。

9） 用基准标本组定容。混匀。

10） 准备n份检测标本和n份对照标本。根据步骤3确定n的值。

11） 按照交替顺序检测检测标本（T)和对照标本（C)（比如，C1T1C2T2C3T3...CnTn）。

 备注：如果系统被样本串行影响，增加额外的样本来保护对照标本免受来自检测标本的串行，比如C1T1CxCxC2T2CxCxC3T3...CxCxCnTn，额外的对照标本（Cx）的结果舍弃。

12） 记录数据分析结果。附件E提供了记录表。

7.1.5 数据分析

计算观察到的干扰效应的“点估计值”，dobs，作为检测标本均值和对照标本均值的差。

 （3）

计算cut-off值，dc，通过使用下列公式来确定接受哪组假设，n为公式（1）或者7.1.3.4节中表2确定的真实标本量。Cut-off值，dc，对双侧检验可使用下式计算：

（4）

其中dnull是空白假设的值，通常=0。

对于单侧检验，用1-α代替1-α/2。

干扰的95%置信区间可以根据下列公式计算。

95%置信区间=

（5）

n个检测标本和n个对照标本的平均差距的标准差是

合理假设待分析物浓度检测的不精密度对检测标本和对照标本是一样的，

其中：

s是检测方法可重复性的标准差，

n是每个标本的重复数目，

t0.972,n-1来自于学生t表作为t-分布n-1自由度下的97.5的百分数。（对于n>30，用2.0替代t0.972,n-1作为合理的估计。）

7.1.6 结果解读

若点估计值dobs小于等于cut-off值dc，推断物质引起的偏差小于dmax；否则，接受对立假设，认为该物质干扰。

当解读干扰试验结果时，考虑下列警告：

由于样本误差，真实的干扰可能与观察到的“点估计值”有差异。然而，如果空白假设真实，接受的置信为100（1-α）%；如果对立假设真实，接受的置信为100（1-β）%。相应的，拒绝的置信为100α%和100β%。

●检测样本的人为属性可能会引入假象。

真实的干扰物质可能不是药品本身，而是代谢物。

检测标本的基质可能不能代表典型的待检测物的病理学标本，可能引入基质效应。

添加的物质可能与病理学标本中的干扰物不同，比如由于蛋白结合、金属螯合、沉淀或者待分析物异构体。

●任意的选择检测浓度可能无法显示出干扰

效应可能只与其他化合物协同表达

干扰可能存在于其他的待测物和干扰物浓度下，而非检测的特定浓度。

7.2 干扰效应鉴定

如果按照7.1节中的测试发现了在一个或者多个待检测物浓度下干扰效应的存在，则准备一个剂量响应系列实验来确定干扰物浓度的干扰程度。干扰物浓度的剂量响应系列实验可由最扰物浓度标本组与对照标本组的梯度混合制备。

7.2.1 实验设计

剂量响应实验可确定干扰物浓度和干扰程度之间的关系，可用于消除检测范围内的干扰物浓度的影响。

一系列检测标本，系统性的仅在干扰物浓度上存在差异，由两种标本组的定量混合制备。一种是检测的最高浓度，一种是检测的最低浓度。所有标本要一起检测，采用随机顺序，置于可重复性条件下。有必要避免分析间变异，比如进行了校准或者试剂批号变化等，可能混淆结果的解读。

检测多个干扰物浓度的好处是相同统计置信条件下检测干扰程度的每个浓度只需较少的重复数目。这是由于从所有标本中获得的可重复性信息汇总在了一起来确定置信区间。

总体上将每个检测浓度采用三个重复即充分。对于想要计算每个浓度下所需重复数目以保证95%置信和幂的人，方程列于附件F中。

7.2.2 检测用品

7.2.2.1 基准标本组

按照7.1.2.1节中所列方法准备基准标本组。

7.2.2.2 储存液

按照7.1.2.1节中所列方法准备潜在干扰物储存液。

7.2.2.3 高值标本组

准备含有5.5节中所规定的潜在干扰物的高值标本组。按照7.1.4所述，用基准标本组稀释储存液来获得目标值。

备注：如果低浓度的内源物质引起干扰，参见7.1.2.2节中的备注。

7.2.2.4 低值标本组

准备含有临床标本群平均干扰物浓度的低值标本组。多数情况下，其可以忽略（如治疗性药物）或者较低（如血红蛋白或者胆红素），低值标本组可按照7.1.2.3节中所述“对照标本组”的方法制备。

7.2.2.5 检测标本组

准备一系列的含有干扰物中值浓度的检测标本组。本流程可用于提供不同标本组中干扰物浓度的更高的相关准确度和精密度，如Vaks的文献报道所述。按下列步骤所述，有高值与低值标本组的梯度混合而来。五个浓度已足够确定线性剂量响应关系了。

1）混合等体积的低值与高值标本组来制备两个极端的中值浓度标本组。

2）混合等体积的低值与中值标本组来制备两个极端的1/4浓度标本组。

3）混合等体积的中值与高值标本组来制备两个极端的3/4浓度标本组。

7.2.2.6 准备规划

图1 指出了假设干扰物的准备计划，病人标本中的正常平均浓度为5mg/dL，而在病理性血清中可能会达到20mg/dL。因此高值标本组需要设定为40mg/dL，低值标本组的浓度应在5mg/dL下检测。

图1 五水平系列检测的准备规划

7.2.3 实验流程

用于剂量响应干扰实验的实验步骤如下：

1） 确定要检测的最高与最低浓度。

2） 确定“临床显著”的差异。如果“配对差异”实验已经完成，则此值已经被确定（参见节7.1.4）

3） 确定每个浓度检测所需的重复数n（参见附件F）。

4） 制备高值与低值标本组。

5） 转移等体积的高值与低值标本组至适当的容器中，制备中值标本组。混匀。

6） 转移等体积的低值与中值标本组至适当的容器中，制备25%标本组。混匀。

7） 转移等体积的中值与高值标本组至适当的容器中，制备75%标本组。混匀。

8） 准备n份混合血清，n由步骤3确定。

9） 在同一分析内检测五个标本组系列。第一组重复应采用升序检测，第二组用降序，第三组用升序，等等，以平均系统漂移效应。

10） 另一个减小漂移效应的方法是按照随机顺序检测所有标本和重复。

11） 计算低值标本组的平均浓度，并从所有其他结果中减去。将净结果列表用于数据分析。

12） 如果实验室已经有检测干扰物的检测方法，其对验证检测到的浓度有一定帮助。

7.2.4 数据分析

对结果绘图，观测到的效应作为y轴，干扰物浓度作为x轴，检查剂量响应关系的形状。

7.2.4.1 线性效应

如果数据随机分布在直线两侧，采用线性最小二乘回归分析。由个体观测值（非平均值）确定斜率、截距和剩余误差。在图标上绘制回归线，确定其拟合了数据且响应是线性的。表3中总结了一个常见的干扰物浓度呈现线性干扰的例子。

表3 线性关系的五水平剂量响应系列检测结果总结

数据绘图并计算线性回归公式，如图2所示。

图2 表3描述的剂量响应实验结果的绘图

95%置信段可以围绕剂量响应线计算出来，根据其可以确定任何干扰物浓度下的95%置信区间。使用图2数据的图表总结如下。

图3 显示9回归线5%置信段的图示。

注意置信区间的大小作为干扰浓度的功能而改变，结果的最大置信处于干扰物浓度范围的中间部分。统计计算器和电脑程序可用于计算回归分析和置信区间。对于计算回归线两侧置信区间的方法，参见如Draper等标准统计学教科书。

7.2.4.2 非线性效应

干扰可能不是与干扰物浓度呈现线性关系。如果绘图数据呈现曲线，对于给定干扰物浓度的恰当的估计常常通过图表确定。表4中数据可用于总结此方法。

表4 呈现非线性关系的五水平剂量响应系列实验结果的总结。

当数据绘图后，如图4所示，任何干扰浓度下的干扰度可以通过图表来估计。也可通过使用二次多项式模型的非线性回归分析来计算。

图4 表4中剂量响应实验结果的绘图

为确定25mmol/L处的预期干扰，绘制一条通过数据的最好的拟合线然后从y轴读出上对应25mmol/L干扰浓度的干扰度。在本例中，干扰可估计为20mmol/L。

置信区间可使用合适的非线性回归分析程序来计算，此程序包含在大部分统计分析套装中。

7.2.5 结果解读

如果关系是线性的，则回归斜率代表每单位干扰物引起的偏差。Y轴截距代表内源干扰物浓度的校正。任何干扰物浓度下的干扰度可由回归公式计算，或者由图表获得，不论关系是线性的或是非线性的。

回顾图2中的数据作为例子，由于斜率为正，实验显示物质引起正向干扰。当干扰物为25mmol/L时，其干扰程度是多大？

从回归方程，我们确定

7.3 评估待分析物与干扰物组合

两个（或多个）潜在干扰物可以在一个实验中更有效的检测，检测物质浓度和待分析物浓度发生系统性变化。个体组成效应通过析因实验来消除。

优点是提高了效率和信息。一次检测所需的实验减少了，干扰物之间的反应，也包括待分析物，可以被评估。潜在的缺点是样本准备更加复杂，增加了人为误差的可能性。

析因实验应用于干扰检测已经被Kroll等人所报道。更多关于多因素实验设计的细节，请参见Box，Hunter和Hunter。

8 使用病人标本评估干扰

7.1节中描述的干扰筛查有明显的。不论多么全面，未预期到的干扰可能会在病人标本中遇到。为减小这种情况发生的可能性，来自相关病人群体的标本应被用来评估固有的标本与标本间的变异。与个体标本关联的可重复的“异常值”结果给予了未知干扰物质的指向。由可重复的标本相关偏差引起的高度的“分散”也可指示干扰物质的存在。

病人标本结果也可以用于证明单株样本池检测指出的干扰。如果已知含有疑问物质的标本中未发现偏差，需要进一步的调查以解决矛盾的观测。

8.1 实验设计

实验基于分析两组病人标本（即，检测组和对照组）使用1）被评估的检测方法和2）参考检测方法或者其他合格的对比检测方法。对应对照组的来自病人亚组的偏差结果指出了干扰。

备注：本节未提供细节的统计流程。

8.2 对比检测方法

已知对干扰敏感度低的检测方法用来在对比研究中建立“真值”。理想状态中，参考检测方法应该用于此目的。如果没有可用的参考流程，可以采用其他合格的对比检测方法（参见EP9）。如果对比检测方法缺乏足够的特异性，得出确定结论的能力就要被折中。下列情况可能会出现：

●特定病人标本中观测到的偏差可能由于任何一个检测引起的。

●两个检测方法间没有偏差可能由于1）对相同干扰物的相似的敏感性，或者2）两者都没有被干扰物影响。

两种检测方法间的关系（系统偏差）可由对照样本的分析来确定。

8.3 病人群体

8.3.1 检测标本

检测标本选择于目的病人群体。已知其含有一种或者多种潜在干扰物质（比如治疗性药品），其来自于确诊处于特定情况或患有特定疾病。

比如病人标本可能基于以下标准来选择：

●相关疾病（如来自心脏、肺或者肾部异常病人的标本）

●相关药剂（如来自已知服用目的药物的病人的标本）

●尿毒症患者（如预透析），其血液中可能含有高浓度的内源代谢物或者药物

●其他可确定的组成部分（如不正常的胆红素、血红蛋白、蛋白质和脂类浓度）

8.3.2 对照标本

对照标本必须横跨相同的待测物浓度范围。选择其依据是因为已知其不含有干扰物质或者他们含有与疾病相关的物质。对照的选择：

●来自于没有服用目的药物的病人

●潜在干扰物浓度正常的病人

●经过相同或者相似的诊断

●待分析物分布类似于检测标本

每次检测必须包含对照组标本。所需测试与对照标本的数量取决于以下三个因素：

●两种检测方法的精密度；

●要检测的干扰效应的程度；

●所需置信水平。

如果效应很明显而且两种检测方法都有很好的精密度，每组10至20个样本即充分。如果需要更多的样本来量化所需置信水平的效应（即，偏差过小以至于被不精密度掩盖了），则效应不太可能具有临床显著性。请参考EP9和EP14的统计学流程来确定所需的样本数目。

●选择检测和对照样本。

●选择合适的参考或合格的对比检测方法。

●在尽可能短的时间间隔里，通常两小时以内，用两种检测方法检测标本的两份重复。时间间隔要合理（取决于待分析物和流程稳定性标准），理论依据需要记录。注意以下事项：

如果待分析物或者潜在干扰物不稳定，如果基质不稳定（全血），或者如果样本量很小（由于样本挥发），时间就尤为重要。这些情况下需特别留意。

将检测分散至几天内，来减少日间不精密度。改变每天两次检测的前后顺序；改变（或者随机）每次检测的对照和检测标本。

如果检测方法可能产生串行，小心设定样本的顺序。

留意任何的系统性差异都可能错误指出干扰。

●如果观察到了偏差，检测样本中药物或者其他潜在干扰物的浓度，来建立偏差和干扰浓度的关系。

8.5 数据分析

如果干扰存在，绘图数据往往能从视觉上指出。对比选择的病人标本数据和对照组数据，并检查是否存在系统性偏差。如果存在，则评估选择的病人标本的结果和对照结果的均值的差异并与干扰标准进行对比。由此，决定干扰是否被排除掉或者需要进一步的调查。下面的方法和例子提供了额外的指导，但是确定引起干扰的原因则超出了本指导原则的范围。

8.5.1 绘制偏差对对比检测值的关系图

当绘制偏差对对比检测值的关系图时，遵循下列步骤：

1） 将结果列表进行数据分析。平均每个标本的两个重复的值。

2） 对于每个标本，计算并记录平均偏差（检测方法结果减去对照检测结果）。

3） 对每个点绘图，偏差作为纵轴，对比检测方法的检测浓度作为水平轴。使用不同的符号代表检测和对照标本。

4） 使用线性回归分析（对比检测方法=x）统计每组数据来确定Sy,x。可用于计算95%置信区间（参见下例）。

8.5.2 评估偏差确定可能的干扰

图5演示了这类实验典型的结果。

图5（A-D）基于病人标本的不同干扰试验的四种可能结果

（变量在文中讨论）

8.5.3 相对于对照组的正向偏差

在图5（A）中，检测组数据（+）显示出了偏差且变异比对照组数据（·）大，显示出相对于对比检测方法来说更收缩的分散块以及可以忽略的偏差。本例中，结果提示了检测标本中某些组分引起了干扰，但并不能下结论，因为置信区间互相重叠（绘制于数据点的右侧，按平均偏差±2Sy,x）这些结果可能由于偶然造成。需要更进一步的调查。

8.5.3.1 相对于对照组没有偏差——成比例的偏差

在图5（B）中，检测组和对照组显示出了正向比例偏差。置信区间基本重叠。不能得出干扰引起的差异。

8.5.3.2 相对于对比检测方法的负向干扰

在图5（C）中，数据显示出清晰的负向干扰。置信区间分离的很开。对照组显示出了正向偏差。注意如果试验中没有包含对照组来校正与潜在干扰无关的系统偏差的话，效应比预期的要显著增大。检测组偏差的上限与对照组的平均偏差的差异可以与干扰标准对比来评估是否可能会有临床显著的干扰。

下列情况可能发生：

●如果对照组与检测组的平均差既有临床显著性又有统计显著性，可以下结论认为检测到了临床显著干扰。

●如果上述差异是统计显著但不是临床显著，则没有检测到临床显著差异。

●如果差异是临床显著但不是统计显著，则需要更大的样本规模。

8.5.3.3 相对于对照组没有偏差

在图5（D）中，相对于对照组，检测组的平均偏差呈现轻度负向。然而，此程度的干扰需要考虑相对于对照组的较大程度的变异。置信区间显示结果没有统计学差异。

8.5.4 绘制偏差对潜在干扰物的关系图

如果疑似干扰物的浓度可以测量出来，则确定其浓度是否能与观测到的偏差关联起来。

图6 偏差与疑似干扰物浓度的关系图

1）以偏差（检测结果减去对比检测结果）作为纵轴，潜在干扰物浓度作为横轴。图6总结了能与潜在干扰物浓度呈现良好关联的观测到的效应。构建与解读“偏差关系图”的方法在EP9中可见。

2）检查偏差对疑似干扰物浓度关系图。如果关系呈线性，分散点贯穿整个范围，则可以同时分析所有数据。干扰效应与干扰物浓度的关系可以由7.2.4节中描述的线性回归分析确定。

另一种可选方法，如果关系不是线性：将数据分为小浓度范围的多个子集，然后计算各个子集数据的平均偏差（干扰）和平均浓度。由此可指出由于检测物质引发的干扰的程度。

8.6 结果解读

使用病人标本的局限主要是缺乏检测变数的对照，以及需要高特异性对比检测方法来进行对结果的权威解读。

●注意：本实验仅指出偏差对应特定物质的关联；其并不证明引发效应的关系。真实的干扰物可能是恰巧与疑似干扰物同时存在的物质。比如，由于疾病产生的生化代谢物引起的干扰可能会被错误的归结为用于治疗疾病的药物。

●如果标本不是新鲜的，不稳定的组成物（如乙酰醋酸盐，CO2）可能会损失。

●住院病人通常会接受多种药物（或多种药物疗养）可能会提高内源代谢物的浓度。

●预期的按疾病和用药将病人分组可能会很难实现。

●在病人样本中干扰可能没有出现。

●对比检测方法可能对干扰的特征不够充足。也可能会被相同的干扰物影响。

无论如何，本方法在提供可能被遗漏的干扰物质的线索上被证明是宝贵的，其也可能是唯一能检测药物代谢物引起的未预期的干扰的方法。参见附件A中关于使用分离技术或者免疫化学检测方法的检测的特殊考虑。

9 建立、证明与验证干扰声明

这些指导原则可被制造商用来探明和证明特异性并建立干扰声明，也可被临床实验室用来证明制造商的声明并验证其检测方法的特异性满足临床需求。一个良好的检测方法允许临床实验室影响制造商的数据来满足其自身的证明与验证要求。本节描述了干扰评估验证所需要的要求。

证明与验证是在临床实验室、医学设备和软件工业中有些许使用上的差异的相似的概念。本指导原则使用ISO9001、ISO151和HS1定义的术语。两个术语都指提供必须要求已被满足的客观证据。证明表示使用者（或者监管机构）的要求已经被满足（如对于病人结果的准确度要求），而验证表示特定的标准已经被满足（如干扰标准或者干扰声明）。

9.1 建立干扰声明

干扰是检测方法应用于预期用途的局限性。对于商品检测方法，已知干扰的物质应在使用说明中注明。检测中证明不产生干扰的物质也应注明，这样实验室就可以验证检测对于服务的病人群体适用度。

临床实验室要求来自于制造商的以下信息：

●声明中涵盖的待分析物与干扰物浓度；

●参与潜在干扰性评估的物质的名称；

●已知产生干扰的物质的化学名和/或通用名；

●用于定义临床显著干扰的标准；

●某物质产生干扰的临界浓度；

●95%置信下在特定待分析物浓度下观测到的干扰度；

●评估步骤（如果EP7没有被引用，描述方法并阐明用来确定干扰的幂和置信水平）。

三种可接受的方法可用于陈述干扰声明。

1） 干扰声明可指出当干扰物质高于某一浓度时，其引起的偏差超过干扰标准（幂=95%）

2） 干扰声明可指出当干扰物质低于某一浓度时，观测不到干扰（置信水平=95%）

3） 干扰声明可以只指出已被报道会对检测方法造成干扰的物质。当定量信息无法获得时此方法较合适。比如，已出版的报道提供了证据证明服用了特定药物的病人的结果不符合真值。如果误差程度是临床显著的，制造商应该1）进一步调查以明确和注明干扰；或者2）注明该物质已被报道会产生干扰并引用文献参考或其他数据来源。

检测并证明不会产生干扰的物质应被总结并提供给用户。可以以“特异性”声明的形式提供（参见9.1.2节）。

用于干扰声明和特异性声明的模板提供如下。其他方法也可接受，但实验室鼓励采用解读的一致性。

9.1.1 干扰声明

例1 干扰物浓度系列测试结果：

AST检测方法根据EP7进行了干扰评估。以下常见物质，当添加至血清中，在列出的浓度下产生干扰。超出10%的偏差被视为显著干扰。

注意：不要试图基于这些数据对待分析物结果进行校正。待分析物与干扰物浓度之间的关系未确定。

例2 胆红素检测方法——两水平干扰筛查：

胆红素检测方法按照EP7进行了干扰评估。当添加至血清中，以下常见物质在所列的待分析物浓度和干扰物浓度下产生干扰。超过0.2mg/dL的偏差被视为干扰。

注意：不要试图基于这些数据对待分析物结果进行校正。待分析物与干扰物浓度之间的关系未确定。

9.1.2 特异性声明

下列物质，根据CLSI步骤，当检测AST活性为25U/L和200U/L的血清时，未发现在所列浓度下产生干扰。小于10%的偏差不被认为是显著干扰。制造商应要求应该报告观测到的偏差，响应95%置信的偏差，实验的标准差和样本规模。

9.2 验证分析特异性

验证表示客观指出特定的标准已被满足。可接受标准应基于医学要求来建立（参见节5）。

制造商必须验证其检测方法的特异性符合来自于其中间客户——临床实验室的设计标准。

临床实验室必须验证其检测的性能，包括特异性，符合制造商的声明，或其需要证明检测方法符合来自于其中间客户——内科医生的准确度要求。

显然，这些行为都是紧密相连的。制造商的要求必须满足医学需求。然而，实验室可能会强加更多严厉的性能要求，因为错误结果可能会导致不必要的疑难排除并损害内科医生对实验室的信心。

可能需要建立额外的标准来为错误结果，或者“离群点”，在预定病人群体中出现的可允许频率。因为潜在的未预计到的干扰，准确度标准通常建立为如99%或95%个体结果必须落在特定的可允许误差内。该标准必须被检测方法的医学要求证明。

9.2.1 制造商

检测方法特异性的验证表示制造商有客观证据证明符合了预先建立的干扰标准。干扰试验需要在新检测构建的早期开始，这样试验变化可以早于试验转化之前被补足。

对制造商的验证行为的CLSI步骤的必要元素列于下。当所有的元素都包括时，制造商可以声明与EP7的一致性：

●系统性确认了参与评估的潜在干扰物（参见5.4节）；

●建立了基于用户要求的干扰标准（参见5.1节）；

●实施了综合性的干扰物筛查（参见7.1节）；

●确定了引起干扰的浓度（参见7.2节）；

●产品标签/使用说明中描述了实验室要求的干扰与特异性信息（参见9.1节）。

9.2.2 临床实验室

验证检测方法的特异性表示实验室有客观证据证明符合了其对干扰的标准。在此种目的下，如果应用于实验室服务的病人群体中，制造商的标准和数据可被实验室接受。

如果实验室不能依赖制造商的验证数据或其他干扰信息来源，实验室必须建立自己的标准并实施对多数可能干扰源的自行评估。节9.2.1 列出了为达到和本指导原则一致性的评估步骤。

实验室也可能需要验证满足了特定的干扰声明。此话题包含在9.4节中。

9.3 证明分析特异性

证明表示客观指出符合了客户要求。证明的程度应与由干扰物质引起的错误结果的风险一致。

9.3.1 制造商

证明表示提供客观证据证明方法的特异性，包括标签声明中的任何局限性，符合其中间客户（如临床实验室）的功能要求。客户需要主要与准确度的医学要求相关。

本指导原则对于制造商证明的必须元素包含相关病人群体评估。节7描述了怎样确认天然病人标本中观测到的效应和怎样评估相关病人群体中非预期的干扰物质。这些在内部或外部性能试验中的证明行为一般都和EP9中的方法比较实验相关联。

9.3.2 临床实验室

证明表示提供客观证据证明方法的特异性，包括标签声明中的任何局限性，符合其中间客户（如内科医生）的医学要求。

干扰是方法和临床标本的特征之一，综合的干扰评估可能超过了实验室的能力。实验室可以接受制造商的标准与数据如果其能够表明：1）制造商检测的物质与其群体相关；2）用于确定干扰的标准对于其客户的需求是合适的；3）使用了科学有效的实验步骤实施了干扰评估。使用制造商标准与数据的依据需要记录。

如果实验室不能依赖制造商的证明数据，其必须实施针对相关病人群体的评估。证明代表性的病人标本的结果符合新检测方法和另一个商业检测方法能提供充足的证明。评估步骤和接受标准（如个体病人结果必须落在特定偏差范围的百分数）需要预先建立。错误结果应该按照节10中的描述进行调查。

9.4 验证干扰和特异性声明

干扰和特异性声明可以通过实验验证。合适的方法取决于声明的类型。

9.4.1 最大干扰声明

声明的干扰度小于指定的最大值。例如：1mg/dL的镁在钙结果范围为8到14mg/mL时的效应小于0.2mg/dL。

为验证此说法，使用7.1.4节中的方法在合适的镁和钙浓度下实施配对差异实验。计算平均效应（xd）。如果小于0.2mg/dL，声明可被接受，否则，被拒绝。

9.4.2 观测到的干扰的声明

干扰实验的结果可能给出。例如：1mg/dL的镁存在时，正常血清群中钙结果为高于对照值+0.14mg/dL。

为验证此说法，实施配对差异实验来检测干扰小于等于0.14mg/dL的空白假设。对立假设为大于。

9.4.3 非定量的干扰声明

当报道的干扰不包含定量信息时（比如，“氨甲蝶呤被报道会对此检测方法产生干扰”），统计学验证没有必要。用于确定干扰程度的实验如7.2节所述。

9.4.4 特异性声明

某陈述，“水杨酸盐不会对本实验流程产生干扰”。可以被实验验证。实施配对差异实验（参见7.1.4节），空白假设处在待分析物的医学决定浓度下，设定干扰的合理标准（5.1节），并按照7.1.5和7.1.6节的描述分析和解读结果。

10 调查异常病人结果

每个实验室都会偶然遇到异常结果。内科医生可能会报告称结果与诊断或者之前的结果不一致，或者实验室会发现两种检测方法之间的差异。如果特定病人的值可以重复并且检测是正确的标准化了的，那么可能的原因就是干扰。

可以遵循下列疑难解决策略来调查异常结果。如果干扰被证实且干扰物质被识别，实验室应该向制造商报告其发现并在检测手册里包含该信息。

备注：预测实验室可能遇到的所有情况是不可能的。这些推荐方案用于指导。需要根据特定环境进行必要修正。

10.1 验证系统性能

在调查开始前，验证系统性能是可接受的。寻找可能引发异常结果的偶然性系统故障的指征。

●检查质控记录并验证系统一直在控内运行。

●分析新鲜制备的质控标本来验证系统性能仍在控内。

●确认检测方法经过恰当的校准和维护。

10.2 评估样本质量

接下来，检查标本的明显问题。寻找可能解释异常结果的任何不正常特征的指征。

●视觉检查样本是否含有纤维蛋白凝块、溶血、升高的胆红素、血脂、浊度以及其他视觉上的异常。如果有，确定是否和观测到的偏差一致。

●验证使用了推荐的收集流程、合适的防腐剂，抗凝剂等等，标本被恰当的收集、运输和储存。如果不是，确定是否会是可能的原因。

●排除标本交叉污染和其他标本处理错误。如果发生错误，确定其是否能解释异常。

10.3 确定原始结果

在进一步处理前，确定样本能够说明样本特异性偏差。建立能够最合理使用剩下的可靠样本的调查计划。

●在相同样本上重复分析以排除作为原因的随机误差（不精密度）或偶然误差（离群点）。

●如果可能的话，检查同一样本的之前的实验室结果。可能会显示出与特定的医学干预或其他病人情况变化的关联。

●稀释并重新检测样本。如果稀释后计算的结果高于或低于未稀释的标本，正向或负向干扰物质可能存在。

●用不同检测规则分析样本，包含其他标本作为对照。如果必要，送至其他实验室进行分析。

●收集并重分析同一病人的另一个标本，和/或来自接受了相同或相似诊断和用药的病人的标本。根据结果提示的调查方向继续。

10.4 鉴别潜在干扰物质

如果差异结果被确认，系统正常工作，尝试识别干扰物质。

●查看产品标签寻找可能存在的已知干扰物质。

●确定病人的诊断和医疗状况。检查最近的诊断和治疗，比如手术、麻醉、输血、放疗和物理治疗，如前列腺按摩。

●查看病人的用药记录。检查最近的处方药物，营养输入、放射性同位素，也包括非处方药和维生素。

●确定病人是否正在采用非正常的食谱。如果是，有可能是异常结果的原因。

●联系制造商并咨询是否收到了相似的报告。将发现报告给制造商并要求协助确定起因。

10.5 确定可能的干扰物

一旦识别出潜在干扰物质，检测最可能的候选。快速、低幂水平的实验可用于检测较大的效应。

1）从健康、未服药的人中抽取2mL血清作为待测。

2）如果待分析物在健康个体中不常见，加入足量的物质来代表典型浓度。

3）将新鲜标本群分装为1mL。

4）准备待测物质的浓缩储存液。要求达到50x到100x的预期血清浓度。

5）向1.0mL血清中加入50μL的储存液。标记为“检测样本”。

6）向另一份1.0mL血清中加入50μL用于制备储存液的溶剂。标记为“对照样本”。

7）在同一检测中检测每个样本的两个重复。

8）计算检测和对照结果的差异。

9）如果差异超过了实验室的干扰标准，通过与该浓度下检测方法的可重复性（分析内精密度）对比，排除由于不精密度引起的偶然因素。如果结果是由于精密度超过了预期的不确定度。则提示干扰是可能的原因。如果结果是否定的，未识别的物质（如药物代谢物）引起的干扰不能被排除。

由于不精密度引起的不确定度可以由检测时待分析物浓度或其附近的已知的重复性标准差来估计。此方法假设了对照和检测样本的相似的可重复性。对于双重复检测，用95%置信的2倍SD。

10.6 识别干扰

一旦确定了可能的干扰物质，实验室应该尝试去和制造商一起证实并识别其对检测方法的效应。节7.2中的方法可用于此目的。制造商有义务调查临床显著异常报告并因此依赖获得来自客户的相关数据。如果新的干扰被证实，制造商要从所有用户利益出发，在产品标签上包含此信息。