葛根素及葛根提取物在大鼠体内药代动力学研究 (1)

李煦颖,赵 妍,王 琳,张懋

,王 欣,孟胜男

(中国医科大学药学院药剂学教研室,辽宁沈阳110001)

摘 要:目的考察葛根素及葛根提取物在大鼠体内的药代动力学差异。方法大鼠分别灌胃给予葛根素(500mg/kg)或葛根提取物(相当于葛根素500mg/kg),在不同时间点采血,以对羟基苯甲酸为内标,应用高效液相色谱法测定葛根素血药浓度,采用DAS 2.0软件计算药动学参数。结果葛根素及葛根提取物在大鼠体内药动学过程均符合二室模型,比较二者主要药动学参数:提取物组较葛根素组的AUC 0 t 、C max 显著降低,T max 、t 1/2z 、CL /F 及V z /F 显著增加。结论葛根素及葛根提取物的主要药动学参数具有显著性差异,葛根提取物中复杂成分的存在能影响其有效成分葛根素的体内药动学行为。

关键词:葛根素;葛根提取物;药代动力学;高效液相色谱法

中图分类号:R969.1 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(2009)06 0383 04

Study on pharmacokineics of puerarin and puerarin crude extract in rats

LI Xu ying,ZHAO Yan,WANG Ling,ZHANG Mao fan,W ANG Xin,MENG Sheng nan

(China Medical University ,Shenyang 110001,China)

Abstract:Purpose To compare pharmacokineics of puerarin and crude extract in rats.Methods Rats re ceived 500mg/kg puerarin and puerarin crude extract by oral administration respectively.Hydroxybenzoic acid was selected as internal standard and the plasma c oncentration of the puerarin and crude e xtrac t was analyzed by HPLC.The pharmac okinetics parameters were calculated with DAS2.0.Results The pharmacokinetics of puerarin and puerarin crude extract was both best fitted with two compartment models in rats after oral adminis tration,and the pharmacokinetics main parameters of the two formulations were different:the AUC 0 t and C max of puerarin were much greater than those of puerarin crude e xtract,but T max ,t 1/2z ,C L /F and V z /F were much lesser than those of puerarin crude extract.Conclusion The comple x components in pueraria crude extrac t can affect the pharmacokinetics of puerarin in rat in vivo .

Key words:puerarin;pueraria crude extract;pharmacokinetic;HPLC 收稿日期:2009 07 06

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(编号20082103)作者简介:李煦颖(1985 ),女,青海西宁人,硕士研究生:E mail:ji ying719@hotmail.co m;孟胜男,通信作者,女,副教授,Tel/Fax:024 ******* 5467,E mail:shengnanmeng@yahoo.com.cn 。

中药的药代动力学研究是中药新药研发的重要内容,但由于中药以多种形式(如中药有效成分单体、单味中药、复方制剂等)应用于临床,所以其药动学研究变得极为复杂。中药中复杂成分不仅对药动学测定指标的检测造成干扰,而且会影响体内药动学行为。中药的有效成分单体可能与其它成分发生协同或拮抗作用,从而导致中药以不同形式应用时的体内药动学行为存在显著差异。如对丹参提取物与丹参有效成分隐丹参酮的药动学研究显示,两者

在大鼠体内药动学过程存在显著差异,提取物中其

它成分可使隐丹参酮吸收速度加快[1];延胡索乙素和延胡索炮制品提取物的药动学比较显示,炮制品提取物能缩短延胡索乙素的达峰时间[2]。因此,中药药动学研究应考虑复杂成分对测定指标的影响,进行综合判断。

据报道,即使是提取后制成的葛根素注射液中也还含有多种有关物质[3]

。本实验选择葛根为研究对象,比较葛根素及葛根提取物在大鼠体内药代动力学差异,考察葛根提取物中其它成分对葛根素体内药动学行为的影响,为临床合理用药提供理论依据。1 材 料

Lab Alliance HPLC 仪、Model 500紫外检测器(美国SSI 公司);N2000双通道工作站(浙江大学智达信

息工程有限公司)。

葛根素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110752 200511);对羟基苯甲酸对照品(含量99%,衢州市瑞尔丰化工有限公司);葛根素(含量99.3%,成都龙泉高科天然药业有限公司,编号:20081001);葛根提取物(自制,葛根素浓度为44.67 g/mL);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司);其它试剂为分析纯。

雄性SD 大鼠,体重(250 20)g,中国医科大学动物中心提供,许可证号SYXK(辽)2008 2005。2 方 法

2.1 给药及样品采集

取SD 大鼠12只,称重,随机分为2组(葛根素组,葛根提取物组),每组6只,实验前禁食,自由饮水。葛根素(50 g/mL)、葛根提取物(葛根素浓度为44.67 g/mL)均按500mg/kg 灌胃给药。于给药前及给药后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,4,6,8,12,16h 眼眶静脉采血0.5mL,肝素抗凝,5000r/min 离心10min,取上层血浆备用。2.2 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C 18柱(250mm 4.6mm,5 m);流动相:甲醇 水(29 71,含0.05%磷酸);流速:1.0m L/min;检测波长:249nm;进样量:20 L 。2.3 溶液配制

葛根素系列标准溶液的配制:精密称取葛根素对照品20.0mg 于100mL 量瓶中,甲醇溶解,定容,摇匀,作为葛根素对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量至25mL 量瓶中,用甲醇配成浓度分别为0.2,0.4,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0 g/mL 的葛根素系列标准溶液。

内标溶液的配制:取对羟基苯甲酸对照品适量,精密称定,置25mL 量瓶中,用甲醇溶解,定容,摇匀,作为对羟基苯甲酸对照品储备液。精密量取储备液适量,用甲醇配制成2 g/mL 的内标溶液。2.4 血浆样品处理方法

精密吸取大鼠血浆样品100 L,依次加入内标溶液50 L,甲醇350 L,涡旋3min,10000r/min 离心10min,取上清液20 L 进样,记录色谱图。2.5 血浆样品测定方法的建立与验证

2.5.1 标准曲线的制备 取空白血浆100 L,加入葛根素标准系列溶液50 L,混匀,制成相当于葛根素血浆浓度分别为0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 g/mL 的溶液,除不加入甲醇外,其余按2.4项下方

法进行处理,建立标准曲线。以葛根素对照品的浓

度(C , g/m L)为横坐标(X ),葛根素与内标的峰面积比(A 药/A 内标)为纵坐标(Y ),求得标准曲线及回归方程。

2.5.2 回收率与精密度测定 取空白血浆100 L,配制低、中、高3个浓度(相当于葛根素血药浓度为0.125,1.00,8.00 g/mL)的质量控制(QC)样品,各浓度5个样本,连续测定3d,并与标准曲线同时进行,以当日的标准曲线计算QC 样品浓度,求算方法的精密度;以处理后的峰面积与未经处理直接进样获得的色谱峰面积之比,考察样品的回收率。2.5.3 稳定性实验 制备低、中、高3个浓度(相当于葛根素血药浓度为0.125,1.00,8.00 g/mL)的QC 样品,各浓度的样品数为3个,分别考察血浆样品冻融循环3次、长期-40 (10,20,45d)冷冻保存以及经处理后的进样溶液室温放置24h 的稳定性。2.6 数据处理

将所得血药浓度 时间数据用药动学软件DAS2.0软件处理进行拟合,求算大鼠口服葛根素和葛根提取物的药动学参数,并进行比较。3 结 果

3.1 分析方法的专属性

分别取空白血浆、加葛根素和内标的空白血浆、葛根素灌胃血浆样品、葛根提取物灌胃血浆样品,按2.4项下方法处理后,在上述色谱条件下各进样20 L 。色谱图见图1,结果显示葛根素和内标的保留时间分别为20.8,16.7min,血浆中内源性物质不干扰葛根素和内标的测定。

1.内标;

2.葛根素1.Internal s tandard; 2.Puerarin

A.空白血浆;

B.加葛根素和内标的空白血浆;

C.葛根素灌胃血浆样品;

D.葛根提取物灌胃血浆样品

A.Blank plas ma;

B.Plas ma spi ked with puerari n and i nternal standard;

C.Plas ma s amples obtained from rats after a single po treatment with 500mg/kg of puerari n;

D.Plas ma s amples obtained from rats after a single po treatment w i th 500mg/kg of puerarin crude extract

图1 葛根素血浆样品色谱图Fi g.1 Representative chromatograms

3.2 标准曲线及最低定量限

求得回归方程为Y =0.61X +0.1118,r =0.9995,血浆中葛根素的浓度在0.1~10.0 g/mL 范围内线性关系良好。本实验条件下测得葛根素的定量限为0.1 g/mL 。

3.3 精密度与回收率

低、中、高3个浓度的样品日内、日间精密度与回收率结果见表1,结果显示该方法可满足生物样品分析的要求。3.4 稳定性

表1 葛根素血浆样品日内、日间精密度与回收率(x s ,n =5)

T ab.1 The intra day and i nter day precision and recovery of puerarin in plas ma (x s ,n =5)配制浓度/( g/mL)

日间

测得浓度/( g/m L )RSD /%日内

测得浓度/( g/mL)RSD /%回收率/%0.1250.123 0.005 4.30.128 0.006 5.185.8 2.21.00 1.02 0.06 6.1 1.02 0.087.495.7 5.18.00

8.23 0.20

2.4

8.08 0.35

4.3

82.8 2.1

考察了低、中、高3个浓度的血浆样品经冻融循环3次、长期-40 (10,20,45d)冷冻保存以及处理后的进样溶液室温放置24h 的稳定性,RSD 均小于15%,表明样品中葛根素无明显降解,在冻融、长期冷冻、室温状态下均保持稳定。

3.5 药动学结果

大鼠灌胃给药葛根素与葛根提取物500mg/kg 后,进行血药浓度测定,所得数据用DAS2.0软件处理,结果表明葛根素与葛根提取物在大鼠体内的药动学过程均符合二房室模型。灌胃给药后主要药动学参数见表2,药 时曲线见图2。

表2 分别灌胃给予大鼠500mg/kg 葛根素与葛根提取物后药动学参数(x s ,n =6)

Tab.2 Pharmacoki netics parameters after oral adminis tration 500mg/kg puerarin and pueraria crude extract in rat (x s ,n =6)

参数

葛根素葛根提取物T max /h 0.63 0.140.38 0.141C max /( g/mL)9.84 0.70 4.27 0.762t 1/2z /h

5.24 0.33

8.30 2.081(C L z /F)/(L kg -1 h -1

)9.73 1.1622.80 3.602(V z /F)/(L kg -1)73.2 6.1272.0 77.02

AUC 0 t /(mg h L -1)45.8 5.216.9 2.32AUC 0 /(mg h L -1)52.0 6.622.3 3.32MRT 0 t /h 4.73 0.28 5.38 0.322MRT 0 /h

6.96 0.48

10.90 2.702

与葛根素组比较:1P <0.05,2P <0.01

1

P <0.05,2P <0.01vs puerarin group

4 讨 论

目前,临床应用的葛根制剂形式多种多样,如葛根素注射液、葛根素片等是以葛根素单体为主要成分的制剂,也有以葛根提取物的形式应用的葛根汤或复方葛根制剂等。这些制剂在临床主要用于治疗心血管疾病。由于葛根还具有一定的抗肿瘤和抗氧

化等活性[4],因此在临床应用较为广泛。有研究显

- -.葛根素;- -.葛根提取物- -.Puerarin;- -.Puerara crude extract

图2 分别灌胃给予大鼠500mg/kg 葛根素与葛根提取物后平均药 时曲线(n =6)

Fig.2 M ean plas ma concentrations ti me curve after oral adminis tration of 500mg/kg puerarin and puerarin crude extract(n =6)

示,葛根素单体扩张冠脉血管的作用强于葛根提取物[5 6];葛根提取物的抗肿瘤活性和抗氧化活性均强于葛根素单体[7 8];葛根素和葛根提取物对细胞色素P450(CYP450)的影响及其机制也表现出较大的差异[9]。两者这些药理、生理活性的差异可能与药动学差异有关。本研究结果为研究葛根制剂的药效学差异与药动学之间的相关性奠定了一定基础。

本实验以葛根素为测定指标,采用HPLC 研究葛根素单体、葛根提取物经口服给药在大鼠体内的

药动学特征。本方法具有专属性高、准确度好、稳定等特点,可用于葛根素药动学的研究。

本研究证实,大鼠灌胃给予葛根素与葛根提取物后的药动学行为具有显著性差异。提取物组较葛根素组的AUC 0 t 、C max 显著降低,表明以提取物应用时会影响葛根素的血药浓度,会降低其生物利用度;提取物组较葛根素组t 1/2z 增加,V z /F 显著增加,最终表现为CL z /F 显著增加,表明提取物中其他成分可加快葛根素在体内的消除;两组MRT 也有明显的差异,表明以葛根提取物应用时,葛根素在体内的分布比单体应用时分布广,体内滞留时间延长,容易造

本研究提示,葛根提取物中复杂成分能影响其有效成分葛根素的体内药动学行为。结合其它研究结果,提示我们在临床应用单味中药或中药复方制剂时,应考虑中药提取物中其它复杂成分对有效成分药动学的影响,这些影响可能会造成其药理作用及临床疗效的差异。因此,研究中药的药动学,仅对其中某一有效成分单体进行药动学研究不能反映该中药的整体药动学特点,应对其有效成分及其影响因素进行全面研究,才能得到科学准确的数据,才能为临床合理用药提供切实、可靠的理论支持。

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重组人成纤维细胞生长因子 21对2型糖尿病模型大鼠LXR

及GLUT1mRNA表达的调节作用

邹文萍1,张羽飞1,王会岩1,2,武 艳1,袁晓环1,初彦辉1

(1.牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室,黑龙江牡丹江157011;

2.吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春130118)

摘 要:目的研究重组人成纤维细胞生长因子 21(rhFGF 21)对2型糖尿病(T2D M)模型大鼠LXR 及GLUT1 mRNA表达的调节作用。方法将T2DM大鼠模型随机分组,每日皮下注射rh FGF 21,8周后,测定大鼠空腹FBG、FA、TG、TC、HDL C、LDL C含量,采用RT PCR方法检测LXR 及GLUT1mRNA的表达水平。结果(1)rhFGF 21能稳定降低T2DM模型大鼠血糖。(2)rhFGF 21用药组大鼠较T2DM模型组大鼠LXR 和GLUT1mRNA表达量显著增加。(3)大、中剂量rhFGF 21能显著降低T2DM模型大鼠血清FA、TG、TC、LDL C含量,同时显著升高血清HDL C含量。结论rhFGF 21能上调T2DM模型大鼠LXR 、GLUT1mRNA表达,增加基础水平的葡萄糖转运,从而降低血糖,改善脂质代谢紊乱。

关键词:重组人成纤维细胞生长因子 21;2型糖尿病;肝X受体;葡萄糖转运蛋白1

中图分类号:R963 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(2009)06 0386 04

The regulatory effect of recombinant human fibroblast growth factor 21on the expression of liver X receptor and glucose transporter protein1in the type2d iabetes rats

ZOU Wen ping1,Z HANG Yu fei1,W ANG Hui yan1,2,W U Yan1,YUAN Xiao huan1,CH U Yan hui1

收稿日期:2009 07 22

基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(D2007 99)

作者简介:邹文萍(1978 ),女,黑龙江佳木斯人,硕士研究生,主

要从事生物蛋白对糖尿病影响机制的研究;初彦辉(19 ),男,通信

作者,教授,Tel:0453 ******* 3634,E mail:yanhui-chu@sina.com。