Ni-NTA sefinose Resin BIO BASIC.DOC

（以下步骤成功地应用于我方实验室，不排除其他操作流程的可行性）

1.对于在E.coli与酵母菌中表达的蛋白：首先稀释细胞浆液：每克中加入5-10mL的binding buffer。这一步是必要操作，为了使得样品与缓冲液中含有相当浓度的咪唑以防止宿主细胞蛋白与裸露的组氨酸的结合，同时也是为了去除大型悬浮颗粒和高浓度的反应试剂如：EDTA、组氨酸以及柠檬酸（导致NI-IDA树脂失效）

2.酶裂解：0.2mg/mL的溶解酵素，20 μg/ml的DNAse,1mM的MgCl2 ,1mM 的PMSF或其他的蛋白酶抑制剂。必须保证抑制剂对NI柱的吸附能力没有影响。然后在4度下搅拌30min.

3.机械裂解：超声波均质裂解或重复的冰冻/解冻操作等等。

4.调节溶（裂）解产物pH值至7.4：不要用强碱或强酸来调节（以防出现沉淀）。

5.裂（溶）解产物离心：转移裂解液至离心管中，在室温下以12000rpm离心20min(或根据蛋白的性质适当调节温度)

6.收集上清液进行纯化；

7.对于由酵母菌、昆虫或哺乳动物表达体系分泌到培养基中的蛋白质，若出现大量上清液，则通过硫酸铵盐沉淀剂Dialyze和1*PBS来浓缩，然后加入柱中。若大量上清液含有EDTA,组氨酸进而可能影响Ni柱效果，可以直接上柱。

注意：可将最初未澄清样品加入Ni柱（省略步骤5），如果这样，延长步骤3中的裂解时间（如将超声波裂解定位10min）。总纯化时间会随未澄清样品的黏度曾加而延长。

纯化步骤：

1.准备过滤柱

a.轻轻颠倒数次来混合浆液以使树脂完全悬浮；

b.用洗液将适量的Ni 树脂浆液转移到柱上。使树脂沉淀、储存缓冲液流出柱；

c.用四个床体积的wash buffer使柱保持平衡。

2．纯化蛋白

   a.使蛋白与树脂结合

   将上述含有组氨酸标记蛋白的可溶澄清样品缓缓加入柱中（速率0.5-1mL/min）收集保存流过的液体用作分析

   b.洗涤

   用8个床体积的binding/wash buffer来洗涤（洗涤速率1ml/min）

   c.洗提目标蛋白

   用5-10个床体积的Elution Buffer来洗提目标蛋白，收集洗脱液，用20mM Tris-HCL pH8.0或1*PBS，pH 7.4来透析（分离），根据特定目标蛋白决定。

3 变性条件下E.coli中多组氨酸标记的蛋白的纯化（主要在内涵体中表达）

 a.在1*PBS中重新悬浮细胞团粒（每团5ml）,超声波裂解细胞。

 b.12000rpm离心10min收集内涵体。用1*PBS洗涤数次（如有需要）。

 c.用binding/wash buffer溶解内涵体（每团粒5ml），室温下培养30-60min.均质化或超声波裂解也许可以帮助充分溶解。

 d.12000rpm离心20min以去除剩余的不溶物质。小心将上清液移入一洁净管中（不要扰动细胞团粒），将其上Ni柱.(预先平衡过)

e.用wash buffer 过柱3至4次直至280nm的吸收作用几乎消失。

f.用EB管洗提。