叶绿素的提取分离及含量测定

【实验目的】

熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

【实验原理】

如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

如图3-3叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在5nm，吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：

OD1=Ca·ka1+Cb·kb1         （1）

OD2=Ca·ka2+Cb·kb2         （2）

式中：Ca为组分a的浓度，g/L；

Cb为组分b的浓度，g/L；

OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；

OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；

ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值；

kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值；

ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值；

kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值；

从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：

OD663=82.04×Ca+9.27×Cb

OD5=16.75×Ca+45.60×Cb

经过整理之后，即得到下式：

Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD5

Cb=0.0229 OD5-0.00468 OD663

如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：

Ca =12.7 OD663-2.69 OD5           （3） 

Cb =22.9 OD5-4.68 OD663           （4） 

CT = Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD5   （5）

（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。

利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（mg/L）。

[附注]  由于叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-5nm），对仪器的波长精确度要求较高，一般低级类型的分光光度计难以满足要求，至少要中级或高级类型的。而有时还由于仪器受振等原因，会使仪器的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就差了。如果对测定结果发生疑问时，不妨用已知波长的滤光片验证一下，仪器的波长是否正确，如无滤光片，可用商品叶绿素a或b（厂家会标明λmax 数据），对仪器的波长进行验证。由于所需的叶绿素a或b的量很少，又无正确浓度要求，因此不妨自行制备，用纸层析法很快就能分离得到。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有0.5%丙酮的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。

【器材与试剂】

1. 实验仪器   高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管

2. 实验试剂   丙酮、碳酸钙

3. 实验材料   植物叶片

【实验步骤】

1. 色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放入研钵中加纯丙酮5 mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5 mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清夜用80%丙酮定容至20 mL。

2. 测定光密度：取上述色素提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、5nm处的光密度值。

3. 按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。

【注意事项】

1. 由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2. 由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。