分子生物学相关概念

2 熔点温度（Tm值）：Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系

3 多重PCR：是在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶基因多个不同序列的片段（或多个不同靶基因的片段）的技术。

4 Taqman荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

5 Ta克隆：T-A克隆法就是用改良碱裂解法抽提pBluescript SK(+)质粒，用EcoRⅤ将pBluescript SK(+)质粒切成平端，利用Taq DNA聚合酶及dTTP制备pBluescript SK(+) T-A载体. 将β-actin cDNA片段克隆入自制的pBluescript SK(+) T-A载体，经EcoRⅠ及HindⅢ双酶切得到与设定长度一致的β-actin cDNA片段.

6 探针：之所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。

7性内切酶：是能识别和水解双链DNA分子内特异序列的核酸水解酶类。存在于细菌体内，并与相伴存在的修饰酶共同构成细菌的—修饰体系，起外来DNA、保护自身DNA的作用。

简单  

1基因重组的技术路线

一是目的基因的获取

二是目的DNA片段与载体的连接

 三是重组DNA分子导入宿主细胞；

 四是重组子的筛选与鉴定

2性内切酶的识别位点 

通常为4、5或6个核苷酸长度的序列且呈二元旋转对称（回文结构），产生5’黏性末端或3’黏性末端，但有少量酶识别更长的序列或简并序列、

3PCR技术模板制备的基本要求

模板包括基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA等

(1)模板DNA需要有较高的纯度，过多的RNA污染会造成RNA与DNA的杂交或RNA与引物的杂交，导致特异性扩增产物的减少和非特异性产物的增多。

(2)单双链均可，但不能混有蛋白酶，核酸酶，DNA聚合酶抑制剂，DNA结合蛋白类等。

(3)在用RNA作为模板时，须先将RNA反转录为，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应

(4)常规PCR的模板DNA量一般仅需50~100ng左右。

4在基因组DNA分离纯化过程中怎么样保持完整性

   影响核酸完整性的因素

物理因素

    1.机械性剪切——强力高速的溶液振荡、搅拌；

                         溶液快速通过狭长的孔道；

                           细胞突然置于低滲液中爆炸式破裂； 

    DNA溶液的反复冻融 

    2.高温——长时间煮沸

化学因素：强酸，强碱

生物因素：核酸酶 

保证核酸完整性，除了尽量避免以上因素，还应做好以下的措施

0～4℃低温操作

提取高分子线性DNA分子时小心操作

缓冲液的酸碱度控制在pH4～10之间

尽量简化纯化步骤，缩短提取时间

使用核酸酶抑制剂：如金属螯合剂（EDTA、柠檬酸盐）、SDS、蛋白酶

5PCR底物设计原则，分析影响的原因  

•两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补

•长度为18～25个核苷酸

•二条引物之间避免形成引物二聚体

•引物浓度：0.1～0.2μmol/L，浓度过高容易生成引物二聚体

•引物的碱基组成应平衡，C+G 碱基含量在引物中的比例一般以45%～55%为宜 

•引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）

•引物的5´端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）

6  蓝白斑筛选原理

大肠杆菌β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146个aa）和C-段。α肽段的基因位于载体上并含有不影响其ORF（open reading ）的多克隆位点（MCS），而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互补而不能无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。

7PCR标本需不需要纯化，为什么？

灵敏度高，特异性强，对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

8PCR技术中如何控制假阳性和假阴性

假阳性及防治：

污染主要来自：扩增产物的污染（为主要来源），试剂及器材污染、标本间的交叉污染 、实验人员的污染等。

污染的防治：主要方法有两种（1）规范化的实验操作，良好的实验环境（2）使用尿嘧啶DNA糖基化酶

假阴性及防治：

原因：DNA损失，试剂失效，DNA突变，存在酶抑制剂，标本中DNA为充分释放

防治：防止抑制酶活性的因素存在，充分处理标本暴露DNA等

除此之外，应分别设立阴阳性对照组