320国道起点为上海，终点为云南瑞丽姐告口岸，全程3695千米。它全线经过多个省份和众多城市、地区。
在上海，途经闵行等区域 。进入浙江后，经过嘉兴、杭州、富阳、桐庐、建德、衢州等地。进入江西，路过玉山、上饶、弋阳、贵溪、鹰潭、余江、东乡、进贤、南昌、高安、上高、万载、宜春、芦溪、萍乡等县市。
进入湖南，会经过醴陵、株洲、湘潭、湘乡、娄底、涟源、新化、溆浦、怀化、芷江、新晃等。进入贵州，经过玉屏、岑巩、三穗、镇远、施秉、黄平、凯里、麻江、贵定、龙里、贵阳、清镇、平坝、安顺、镇宁、关岭、晴隆、普安、盘州等。
最后进入云南，经过富源、沾益、曲靖、马龙、嵩明、昆明、安宁、禄丰、楚雄、南华、祥云、大理、永平、保山、龙陵、潞西等，直至终点瑞丽姐告口岸 。320国道连接起众多地区，对沿线经济、文化交流和发展起到重要作用。
