320国道起点为上海，终点为云南瑞丽姐告口岸，全程约3695千米。
从上海出发后，途径浙江嘉兴、杭州、金华等地，浙江段串联起多个经济发达且风景秀丽之地，沿途有嘉兴南湖等知名景点。进入江西，经过上饶、鹰潭、南昌、宜春等城市，江西段展示了丰富的红色文化与历史遗迹，如南昌八一起义纪念馆。
接着进入湖南，路过醴陵、株洲、湘潭、娄底、邵阳、怀化等，湖南段呈现多样的地貌与人文风情，能感受到湖湘文化的魅力。进入贵州，经过玉屏、凯里、麻江、贵定、龙里、贵阳、清镇、平坝、安顺、镇宁、关岭、晴隆、普安、盘州等地，贵州段多山地，地形复杂，有黄果树瀑布等壮丽景观。
最后到达云南，经过富源、沾益、曲靖、马龙、嵩明、昆明、安宁、禄丰、楚雄、南华、祥云、大理、永平、保山、龙陵、潞西等，云南段有着独特的民族文化和自然风光，直至终点瑞丽姐告口岸 ，展现出从东部沿海到西南边境的不同地域特色与风貌。
