TaqMan-MGB 实时荧光定量 PCR 检测 RIG-G基因方法的建立及其方法学验证论文

论著・

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－９１５８．２０１６．１２．０１４

作者单位：２０００６５上海，同济大学附属同济医院检验科

通信作者：李冬，电子信箱：１８６ｌｄ＠１６３．ｃｏｍ

ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ检测ＲＩＧ－Ｇ

基因方法的建立及其方法学验证

庞丽 权 吴军录 姚懿雯 李冬

【摘要】 目的 建立一种以ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ荧光探针为特点，检测人类急性早幼粒细胞白血病（Ｍ３型）中维甲酸诱导基因Ｇ（ＲＩＧ－Ｇ）的实时荧光定量聚合酶链反应（ＲＴ－ｑＰＣＲ）方法，并运用该方法对正常人、Ｍ３患者外周血中的ＲＩＧ－Ｇ表达水平进行分析，探讨其在Ｍ３诊断中的价值。方法 方法学建立。针对人ＲＩＧ－Ｇ基因设计特异性引物和ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ荧光探针，以逆转录的互补ＤＮＡ为模板，建立ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法和标准曲线；在方法特异性、正确度、精密度、分析灵敏度、干扰物质等各方面对检测方法的性能进行评估，并用该法验证２０例Ｍ３患者外周血与骨髓中ＲＩＧ－Ｇ表达水平相关性，同时检测４０份正常人及２０份Ｍ３患者标本，ｔ检验比较两组外周血ＲＩＧ－Ｇ水平，用ＲＯＣ曲线分析其对Ｍ３的检测效能。结果 ＲＩＧ－Ｇ标准品拷贝数ｌｏｇ值与循环阈值数（Ｃｔ）的标准曲线方程为：Ｙ＝－３．５３９Ｘ＋４２．９５２，Ｒ２

＝０．９９９，呈良好的线性关系。用建立的实时荧光定量ＰＣＲ方法检测标准品，结果与已知值比较，相关性系数ｒ＝０．９９９，计算偏倚值均＜５％；分别选取高值

（１０７

拷贝／μｌ）、中值（１０４

拷贝／μｌ）、低值（１０１拷贝／μｌ）３个浓度，批内ＣＶ分别为１．３８％、２．３１％、７．５６％；批间ＣＶ分别为０．７１％、１．１７％、５．０７％，均＜１０％；该方法的分析灵敏度为１０１

拷贝／μｌ。Ｍ３患者外周血与骨髓中ＲＩＧ－Ｇ表达水平相关系数为ｒ＝０．９９６，斜率ｂ＝０．９７３，结果相关性良好，ｔ＝０．０９９，Ｐ＞０．０５，显示两组标本检测结果差异无统计学意义。４０份正常健康体检外周血ＲＩＧ－Ｇ基因的拷贝数［３．６２×１０４

（１．６１×１０４

～４．９０×１０４

）拷贝／μｌ］与Ｍ３患者［７．１０×１０２

（５．４３×１０２

～２．２１×１０３

）拷贝／μｌ］差异有统计学意义（Ｕ＝１８，Ｐ＜０．００１）。结论 成功建立了检测人外周血ＲＩＧ－Ｇ基因的ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ荧光实时定量ＰＣＲ方法。该法具有较好的正确度、精密度、灵敏度及特异性，能够为临床Ｍ３患者的早期诊断及治疗监测提供必要帮助。（中华检验医学杂志，２０１６，３９：９３６－９４０）

【关键词】 实时聚合酶链反应； 细胞内信号肽和蛋白质类； 白血病，早幼粒细胞，急性基金项目：国家自然科学基金（８１２７２６０３，８１４７２１７９）；上海申康医院发展中心课题（ＳＨＤＣ２２０１４００８）

ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｆａＲＩＧ－ＧｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｂｙＴａｑＭａｎ－ＭＧＢｐｒｏｂｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲＰａｎｇＬｉ，ＱｕａｎＷｅｎｑｉａｎｇ，ＷｕＪｕｎｌｕ，ＹａｏＹｉｗｅｎ，ＬｉＤｏｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＴｏｎｇｊｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｏｎｇｊｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６５，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｉＤｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：１８６ｌｄ＠１６３．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＴａｑＭａｎ－ＭＧＢｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓＧ（ＲＩＧ－Ｇ）ｉｎｈｕｍａｎａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｍ３）．ＡｎａｌｙｚｅＲＩＧ－ＧｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｂｏｔｈｎｏｒｍａｌｐｅｒｓｏｎｓａｎｄＭ３ｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｄｉａｇｎｏｓｉｓｖａｌｕｅｆｏｒＭ３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｓｔｕｄｙ．ＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＴａｑＭａｎ－ＭＧＢｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｆｔｅｒｄｅｓｉｇｎｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＴａｑＭａｎ－ＭＧＢｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂｅｏｆｈｕｍａｎＲＩＧ－ＧｇｅｎｅａｎｄｕｓｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｉｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｃｙ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．ＴｗｅｎｔｙｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｉｔｈＭ３ｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｆｉｅｄＲＩＧ－Ｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏａｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄａｎｄｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲＩＧ－Ｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆ４０ｎｏｒｍａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓａｎｄ２０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＭ３ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔ－ｔｅｓｔ．Ａｎｄｒｅｃｅｉｖｅｒ－ｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ

万方数据

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ； Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ

Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１２７２６０３，８１４７２１７９）；ＳｈａｎｇｈａｉＳｈｅｎｋａｎｇＰｒｏｇｒａｍ（ＳＨＤＣ２２０１４００８）

维甲酸诱导基因Ｇ（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅＧ，ＲＩＧ－Ｇ）基因是从急性早幼粒细胞性白血病（ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＰＬ；即Ｍ３型，以下简称Ｍ３）细胞系ＮＢ４细胞中克隆到的一个可以被维甲酸诱导表达的基因［１］。ＲＩＧ－Ｇ基因互补ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ，ｃＤＮＡ）ｃＤＮＡ全长１９１９ｂｐ，编码１个含４９０个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量约６００００。ＲＩＧ－Ｇ是一个重要的肿瘤抑制基因，我们前期的研究表明ＲＩＧ－Ｇ通过阻滞肿瘤细胞的细胞周期进程，抑制细胞增殖并且促进其分化［１－３］。当白血病细胞经维甲酸诱导产生ＲＩＧ－Ｇ蛋白后，将对肿瘤细胞的生长产生抑制作用。而在耐维甲酸的Ｍ３细胞株ＮＢ４Ｒ１细胞中，维甲酸并不能够诱导ＲＩＧ－Ｇ表达，因此白血病细胞不能够分化［１，４］。这些特点是ＲＩＧ－Ｇ作为维甲酸治疗效果判定标志的前提。

当前，判断Ｍ３患者病情缓解、复发的主要手段仍是进行骨髓穿刺，这种具有创伤性的检测手段给患者的心理和生理都造成了较大的伤害，亟需找到一种快速无创的检测方法来判读Ｍ３的治疗和预后。因此，根据前期研究的基础建立了ＴａｑＭａｎＭＧＢ探针实时荧光定量ＰＣＲ检测人外周血ＲＩＧ－Ｇ基因的方法并对其做了各项性能分析，以期为Ｍ３的早期诊断及维甲酸治疗后监测提供帮助。

材料与方法

一、材料

１．标本和质粒：留取２０１５年１至１２月同济大学附属同济医院血液科确诊的Ｍ３患者标本２０份（骨髓和外周血同时保存），门诊健康体检者外周血标本４０份用于验证试验，其中来自男２１名，女１９名，年龄１５～８１岁，平均年龄（３７±８）岁，均排除肿瘤、血液病等重大疾病。重组质粒ｐＴＲＥ－ＲＩＧ－Ｇ，

ＡＴＲＡ－ＮＢ４细胞株均由上海交通大学医学院附属瑞金医院血液病研究所童建华研究员惠赠。本研究经过同济大学附属同济医院伦理委员会批准［（同）伦审－ＫＹＳＢ－２０１４－（０２）］，所有研究对象均签署知情同意书。

２．主要试剂与仪器：总ＲＮＡ提取试剂Ｔｒｉｚｏｌ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；逆转录试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭⅡ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ、实时荧光定量反应试剂盒ＰｅｒｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ均购自大连Ｔａｋａｒａ公司；ＤＵ７３０核酸蛋白分析仪购自美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司；７３００ＦａｓｔＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ仪购自美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司。

二、方法

１．总ＲＮＡ提取：抽取２ｍｌ外周血标本用乙二胺四乙酸管抗凝。采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ＲＮＡ。用核酸蛋白分析仪测定ＲＮＡ浓度和吸光度比值Ａ２６０／Ａ２８０。取一部分ＲＮＡ稀释至统一浓度用于后续的逆转录实验，剩余ＲＮＡ置于－８０℃保存备用。

２．引物和ＴａｑＭａｎ探针：按照ＧｅｎＢａｎｋ中ＲＩＧ－Ｇ基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计ＴａｑＭａｎ探针及引物，扩增片段长度为２８６ｂｐ，通过美国国家生物技术信息中心公共数据库Ｂｌａｓｔ功能初步验证引物。ＲＩＧ－Ｇ引物和ＴａｑＭａｎ探针均由上海诺百生物科技有限公司合成并纯化，探针５′端标记的荧光报告基团ＦＡＭ，３′端标记荧光淬灭基团ＭＧＢ，ＲＩＧ－Ｇ－Ｆ：５′－

万方数据ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＧ－３′，ＲＩＧ－Ｇ－Ｒ：５′－ＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧ－３′，ＲＩＧ－Ｇ－探针：５′－ＡＧＧＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＧ－３′。

３．逆转录反应体系：按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ逆转录试剂盒说明书操作，逆转录反应体系共２０μｌ。首先，将通用引物、随机引物各０．５μｌ，三磷酸脱氧核苷复合物１μｌ，１μｇＲＮＡ样本，无ＲＮＡ酶的ｄＨ２Ｏ补足至１０μｌ后混匀，短暂离心，６５℃水浴５ｍｉｎ，立即置于冰上。然后再加入５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔⅡ缓冲液４μｌ，ＲＮＡ酶抑制剂０．５μｌ，逆转录酶１μｌ，无ＲＮＡ酶的ｄＨ２Ｏ４．５μｌ，以上混合物温和混匀。扩增条件：５０℃５０ｍｉｎ、７０℃１５ｍｉｎ。

４．实时荧光定量ＰＣＲ反应体系的建立：按照ＰｅｒｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ实时荧光定量反应试剂盒说明书操作，反应体系共２０μｌ：２×ＰｅｒｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ试剂１０μｌ，正反向引物各０．４μｌ，ＴａｑＭａｎ探针０．８μｌ，５０×ＲＯＸ参照染料０．４μｌ，ｃＤＮＡ模板２μｌ，灭菌蒸馏水６μｌ。扩增条件：预变性９５℃３０ｓ；ＰＣＲ反应９５℃５ｓ、６０℃３１ｓ，４０个循环。

５．标准曲线建立：ｐＴＲＥ－ＲＩＧ－Ｇ质粒稀释至１０１～１０７拷贝／μｌ作为标准品模板，以灭菌蒸馏水为阴性对照，ＡＴＲＡ－ＮＢ４细胞抽提的ＲＮＡ为阳性对照。用上述方法４中描述的ＰＣＲ反应体系进行扩增，以浓度的对数和相应的循环阈值（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ）分别为Ｘ、Ｙ轴制作标准曲线，获得曲线斜率，相关系数（ｒ），并计算扩增效率。

６．分析特异性：是指该方法本身能够检测出特定待测分子的能力［５］。用已建立的检测方法同时检测质粒、健康人、Ｍ３患者外周血提取的ＲＮＡ，灭菌双蒸水。对其ＰＣＲ熔解曲线进行分析，并对ＰＣＲ产物用２％琼脂糖凝胶电泳进一步验证特异性［５］。

７．正确度：是衡量测得值与真值之间的接近程度［６］。本试验我们采用重组ｐＴＲＥ－ＲＩＧ－Ｇ质粒为参考标准品的参考物测定效率来验证正确度。用本实验所设计的ＴａｐＭａｎ探针法分别检测１０１～１０８拷贝／μｌ共８个浓度的标准品，结果与已知值做相关性分析，并分别计算偏倚。

８．精密度：即衡量一个试验的一致性。在相同条件下，同一标本或同一种类的靶核酸分子，在不同时间或由不同操作者用该分子检测技术反复检测所得结果的一致性［６－７］。以ｐＴＲＥ－ＲＩＧ－Ｇ质粒作为标准品，稀释成高值（１０７拷贝／μｌ）、中值（１０４拷贝／μｌ）、低值（１０１拷贝／μｌ）３个浓度。批内精密度：３个浓度标本各连续重复测定２０次；批间精密度：连续测定５ｄ（不同工作人员，不同批次引物），每天重复检测４次，取得２０个结果。计算３种浓度检测结果对数值的变异系数，ＣＶ＜１０％为合格。

９．分析灵敏度：即最低检出下限。给定置信水平为９５％时，样品测定值与零浓度样品的测定值有统计学差异的最低浓度即为最低检出限。将质粒浓度依次稀释至浓度极限１００拷贝／μｌ，选取１０３、１０２、１０１、１００共４个浓度，用所建立的实时荧光定量聚合酶链反应（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ

ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ｑＰＣＲ）方法将各个浓度检测２０次，结果９５％能测出即符合。

１０．干扰物质：取７份黄疸标本（总胆红素１７９～５０３μｍｏｌ／Ｌ）和７份脂血标本（三酰甘油４．０２～１３．５６ｍｍｏｌ／Ｌ）分别经直接抽提ＲＮＡ和通过血浆置换去除黄疸和脂血后再抽提ＲＮＡ，然后用建立的ＲＴ－ｑＰＣＲ方法检测ＲＩＧ－Ｇ，比较不同程度的黄疸和脂血对实验结果的影响。

１１．正常人、Ｍ３患者外周血中ＲＩＧ－Ｇ表达差异：选取同济医院门诊健康体检者外周血４０份、Ｍ３患者外周血２０份用于验证。

三、统计学方法

采用ＳＰＳＳ１９．０统计软件完成数据分析。正态分布的计量资料用-ｘ±ｓ表示，使用配对ｔ检验对Ｍ３患者外周血标本和骨髓标本ＲＩＧ－Ｇ基因表达进行相关性分析，干扰物质与去除干扰物质组间差异性比较用ｔ检验比较。正常人与Ｍ３患者外周血检测数据呈偏态分布，用中位数（四分位）表示，非参数检验分析。ＲＩＧ－Ｇ对Ｍ３的检测效能采用ＲＯＣ曲线判断。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。

结果

一、标准曲线的建立

ＲＩＧ－Ｇ标准品拷贝数ｌｏｇ值与Ｃｔ的标准曲线方程为：Ｙ＝－３．５３９Ｘ＋４２．９５２，Ｒ２＝０．９９９，呈良好的线性关系，扩增效率为９５．２％，扩增曲线和标准曲线见图１，２。

二、分析特异性

由图３可见，靶基因ＲＩＧ－Ｇ熔解曲线峰值单一，未见杂峰，表明ＰＣＲ产物特异性强，没有非特异性产物。将ＰＣＲ产物进行２％琼脂糖凝胶电泳，质粒（泳道１～３）、健康人（泳道４～６）及Ｍ３患者（泳道７～９）在２８６ｂｐ处可见均一清晰条带，而灭菌双蒸水（泳道１０）未出现条带。说明本研究建立的方法具有高度的特异性，见图４。

万方数据

图１ ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ探针法检测ＲＩＧ－Ｇ（标准品）

扩增曲线

图２

标准曲线图

图３ ＲＩＧ－Ｇ

熔解曲线图

Ｍ：ＤＮＡ标准带；１～３：质粒；４～６：正常人；７～９：Ｍ３患者；１０：灭菌双蒸水

图４ 扩增产物电泳图

三、正确度和精密度及灵敏度

８个浓度的标准品用试验方法检测值对数与已知值做相关性分析，相关系数ｒ＝０．９９９，计算出偏倚均＜５％，表明正确度符合要求。对１０７

、１０４

、１０１

拷

贝／μｌ３种不同浓度的质粒重复检测，结果显示批内

ＣＶ分别为１．３８％、２．３１％、７．５６％；批间ＣＶ分别为０．７１％、１．１７％、５．０７％，均＜１０％，在合理范围内，

表明本研究建立的方法精密度良好。不同浓度的质

粒样本平行检测２０次，当浓度为１００

拷贝／μｌ时，２０

次重复测定结果符合率为７５％；当浓度为１０１

拷贝／μｌ时，能稳定检出１９次（符合率为９５％），因此本方法的检测灵敏度为１０１

拷贝／μｌ。

四、Ｍ３患者外周血与骨髓中ＲＩＧ－Ｇ表达水平相关性

采用ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ法同时检测Ｍ３患者外周血标本和骨髓标本，二者相关系数为ｒ＝０．９９６，斜率ｂ＝０．９７３，配对ｔ检验ｔ＝０．０９９，Ｐ＞０．０５，两组标本检测结果差异无统计学意义。表明ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ法检测Ｍ３患者外周血标本和骨髓标本结果相关性良好。五、干扰物质

经过血浆置换处理过的黄疸标本的ＲＮＡ浓度为（２８０．２±８２．６）ｎｇ／μｌ，原黄疸标本的ＲＮＡ浓度（２６４．７±５５．６）ｎｇ／μｌ，ＲＮＡ浓度之间差异无统计学意义（ｔ＝０．４１９５，Ｐ＝０．６９６）；二者检测ＲＩＧ－Ｇ基因表达的结果之间差异也无统计学意义（Ｕ＝９２，Ｐ＝０．４０５）。原脂血标本（三酰甘油＜１３．５６ｍｍｏｌ／Ｌ时）的ＲＮＡ浓度为（３６４．１±１３４．８）ｎｇ／μｌ，置换处理过的ＲＮＡ浓度为（３３１．３±１２７．５）ｎｇ／μｌ，ＲＮＡ浓度之间差异无统计学意义（ｔ＝０．４２９１，Ｐ＝０．６９０）；二者检测ＲＩＧ－Ｇ基因表达的结果之间差异也无统计学意义（Ｕ＝３８７．５，Ｐ＝０．６１３）；表明黄疸、高脂血标本对该方法无明显的干扰作用。

六、健康对照组和Ｍ３患者外周血中ＲＩＧ－Ｇ表达差异

采用所建立的ＲＴ－ｑＰＣＲ法同时检测４０份健康体检标本与２０份Ｍ３患者标本，结果显示４０份健

康体检者外周血ＲＩＧ－Ｇ基因的拷贝数３．６２×１０

４

（１．６１×１０４～４．９０×１０４

）拷贝／μｌ，Ｍ３患者７．１０×１０２（５．４３×１０２～２．２１×１０３）拷贝／μｌ，ＲＩＧ－Ｇ基因在Ｍ３患者外周血中表达低于健康对照组，差异有统计学意义（Ｕ＝１８，Ｐ＜０．００１）。

七、ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ检测外周血ＲＩＧ－Ｇ对Ｍ３的检测效能评价

ＲＯＣ曲线分析显示见图５，ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ检测外周血ＲＩＧ－Ｇ对Ｍ３的ＡＵＣ为０．９７４４，表明外周血ＲＩＧ－Ｇ的荧光定量ＰＣＲ法是检测Ｍ３的一项良好指标。此法的最佳临界值为

５．５０×１０３

拷贝／μｌ，其敏感度为８３．３３％（１７／２０），

万方数据

特异度为１００％（２０／２０），

具有良好的诊断学意义。图５ ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ探针法检测外周血ＲＩＧ－Ｇ对急性早幼粒细胞性白血病的ＲＯＣ曲线分析

讨论

２０世纪８０年代中期，由我国学者首创的应用全反式维甲酸（ａｌｌｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ，ＡＴＲＡ）诱导分

化治疗Ｍ３在临床上取得了巨大成功［８］

。相对于Ｍ３的实验室诊断，关于Ｍ３经维甲酸治疗后的疗效及预后的检测方法却不多，检测效果也不理想。临

床以白细胞计数（当白细胞≥１０×１０９

／Ｌ时复发风险较高）和骨髓中异常早幼粒细胞比例作为重要的

预后因素［９－１０］

。但是这种实验室检查手段可靠性不高或者主观影响大，需依靠检测人员经验，难以标准化，而且需治疗较长时间后才能从检测结果中表现出来。因此找到一种有效和简便的实验室检测方法对维甲酸治疗的预后判断进行评价，将对临床治疗Ｍ３具有极大的贡献。外周血ＲＩＧ－Ｇ基因变化同骨髓穿刺液ＲＩＧ－Ｇ基因变化一致，为今后只需利用外周血方便快捷地检测ＲＩＧ－Ｇ基因作为Ｍ３患者预后指标提供了依据。

ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ方法学建立的关键是要有稳定的标准品，为保证所建立方法的准确性和可靠性，本研究用重组克隆质粒作为标准品，提高检测的准确性及稳定性。结果显示，利用本研究所设计的引物和探针建立的扩增体系，灵敏度

较高，最低检出限为１０１

拷贝／μｌ，具有良好的稳定

性和重复性。线性范围广，达７个数量级（１０７～１０１

拷贝／μｌ），且结果不受高胆红素、高脂血症等影响，可以比较准确地测定ＲＩＧ－Ｇ基因的表达。本研

究方法既有传统ＴａｑＭａｎ探针的特点，又具有一些新的优点如提高信噪比，没有背景荧光，且有更高的

淬灭效率等［１１］

。ＲＯＣ曲线分析表明该法检测Ｍ３具有良好的诊断学意义。

综上所述，本研究建立的ＲＩＧ－Ｇ基因ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，能够从外周血中快速准确地分离、定量检测出ＲＩＧ－Ｇ基因，且该法灵敏度高、特异性强、重复性好、线性范围广、受到的干扰因素少，快速、简便地为全反式维甲酸诱导分化治疗Ｍ３预后进行及时评价，也为维甲酸治疗Ｍ３的早期诊断和监测提供了可能。

参

考

文

献

［１］ＸｉａｏＳ，ＬｉＤ，ＺｈｕＨＱ，ｅｔａｌ．ＲＩＧ－Ｇａｓａｋｅｙｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｔｈｅ

ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｓｔｈｒｏｕｇｈｅｎｈａｎｃｉｎｇｐ２１ａｎｄｐ２７ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００６，１０３（４４）：１６４４８－１６４５３．ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０７８３０１０３．

［２］李冬，楼叶江，肖澍，等．维甲酸诱导基因Ｇ抑制肿瘤细胞

增殖的分子机制研究［Ｊ］．中华医学杂志，２００８，８８（２）：１１０－１１３．ＤＯＩ：１０．３３２１／ｊ．ｉｓｓｎ：０３７６－２４９１．２００８．０２．０１１．

［３］肖澍，贾培敏，宋满根，等．利用稳定转染细胞模型研究

ＲＩＧ－Ｇ基因的生物学功能［Ｊ］．中华血液学杂志，２００７，２８（１２）：７９５－７９８．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｊ．ｉｓｓｎ：０２５３－２７２７．２００７．１２．００２．

［４］ＹｕＭ，ＴｏｎｇＪＨ，ＭａｏＭ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｇｅｎｅ（ＲＩＧ－Ｇ）

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆａｆａｍｉｌｙｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９７，９４（１４）：７４０６－７４１１．

［５］陈娟，李雷，魏红霞，等．ＴａｑＭａｎ－

ＭＧＢ荧光定量ＰＣＲ检测人载脂蛋白Ａ５基因方法的建立及评价［Ｊ］．检验医学，２０１２，２７（５）：４００－４０３．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－８６４０．２０１２．０５．０１９．［６］尚红，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程［Ｍ］．４版．北

京：人民卫生出版社，２０１５．

［７］胡婷婷，陈宇明，张心菊，等．荧光ＰＣＲ结合熔解曲线法检

测ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突变方法的建立及其方法学验证［Ｊ］．中华检验医学杂志，２０１３，３６（９）：７９６－８００．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－９１５８．２０１３．０９．００６．

［８］ＨｕａｎｇＭＥ，ＹｅＹＣ，ＣｈｅｎＳＲ，ｅｔａｌ．Ｕｓｅｏｆａｌｌ－

ｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９８８，７２（２）：５６７－５７２．

［９］ＳｃｈｗａｒｚＪ，Ｋｏｒí

ｓｔｅｋＺ，ＳｔａｒｙＪ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｒａｐｙｏｆａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｉｎＣｚｅｃｈｉａ：ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＶｎｉｔｒＬｅｋ，２００８，５４（７－８）：７５７－７７０．［１０］王琦，韩艳秋．急性早幼粒细胞白血病诊治的回顾及进展

［Ｊ］．中华临床医师杂志（电子版），２０１２，６（２）：４１９－４２２．ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．０２．０３３．

［１１］ＬｅｗＡＥ，ＢｏｃｋＲＥ，ＭｏｌｌｏｙＪＢ，ｅｔａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｖｉｒａｌｂｏｖｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓｂｙ５′ＴａｑｎｕｃｌｅａｓｅＰＣＲｕｓｉｎｇａ３′ｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｂｉｎｄｅｒｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｐｒｏｂｅ［Ｊ］．ＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００４，１１５（２）：１６７－１７５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００３．０９．０２９．

（收稿日期：２０１６－０３－１５）

（本文编辑：武昱）

万方数据