外消旋体的拆分

                                                 021131090 王新珏

Louispasteur在100多年前曾指出：“宇宙是非对称的，如果把构成太阳系的全部物体置于一面跟随着它们的各种运动而移动的镜子前面，镜子中的影像不能和实体重合。……”

生命由非对称作用所主宰。在自然界中存在许多光学对映体，这些物质就像人的左右手，立体结构对称，左右相反，绝不能重合，故称为手性化合物。在漫长的化学演化过程中，地球上出现了无数手性化合物构成生命体的有机分子，无论在种类上或在数量上，绝大多数是手性分子。手性分子的对映体可以有几乎完全相同的物理化学性质，甚至有相同的光谱，但是它们之间仍然存在有重要的差别——手性分子间反应性的差别。其气味、味道以及作用大相径庭：一方有益，而另一方就有害。因此寻求和研究外消旋体拆分方法，与有利于对映体之一的合成方法，特别是得到所需要的纯粹单一对映体的化学合成方法不对称合成成为当前有机化学研究的热点与前沿。

手性物质

我们周围的世界是手性的，构成生命体系的生物大分子的大多数重要的构件仅以一种对映形态存在。生命体系有极强的手性识别能力，不同构型的立体异构体往往表现出极不相同的生理效能。

药物分子的两个对映体以不同的方式参与作用并导致不同的效果。生物体的酶和细胞表面受体是手性的，外消旋药物的两个对映体在体内以不同的途径被吸收，活化或降解。这两种对映体可能有相等的药理活性；或者一种可能是活性的，另一种可能是无活性的甚至有毒的，或者二者可能有不同程度或不同种类的活性。

例1．氯霉素，其中的D-对映体具有杀菌作用，而L-对映体却完全没有药效。

例2．有时一对对映体在体内可能具有相反的作用，这可以用在20世纪60年代发生在欧洲的一个悲剧来说明外消旋的反应：

反应停(Thalidomide)曾是镇静剂和止吐药，用作减轻孕妇早期妊娠反应的药物，后来才发现有些曾服用过这种药的孕妇产下了畸形婴儿，进一步的研究表明，其致畸形是由该药的(S)-异构体所引起的，而(R)-异构体被认为即使在高剂量时在动物中也不引起畸变。

其它如天然的(—)—尼古丁的毒性要比(+)—尼古丁大得多。此外广泛应用于农业的手性除草剂、杀虫剂和植物生长调节剂同样表现出强烈的生物识别作用。

在生物体系中，立体异构体识别是极明显的，一般就手性化合物而言，可能有四种不同的行为：

(1)只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种没有显著的生物活性；

(2)两种对映体都有等同的或近乎等同的定性和定量的生物活性；

(3)两种对映体具有定量上等同的但定性上不同的活性；

(4)各对映体具有定量上不同的活性。(S)—普萘洛尔在化疗中用作β—受体阻断药，它比其(R)—异构体的活性高98位。

它们可能有不同的味道，不同的气味，最重要的是各对映体可能表现出不相同的生理行为。(R)—天冬酰胺有甜味，而天然的(S)—天冬酰胺则是苦的。

(S)—(+)—香芹酮有芫荽的香味，而其(R)—异构体则有留兰香的香味。

这是因为人的嗅觉起决定性作用的受体也是由手性分子构成的，而手性分子在相互作用时要求必须是手性匹配。不少昆虫具有对某种气味的异常敏感性，求偶时释放的性吸引剂有时就是手性物质。舞毒蛾性引诱素是舞毒蛾的性信息素，对映体之一能够吸引雄性果蝇，而它的镜象分子却只能够吸引雌性果蝇。

基于以上这些原因，获得对映纯的化合物对于化学的、生物的或药学的应用目的是必要的。服用对映纯药物可减少剂量和代谢负担，提高剂量的幅度并拓宽用途，对药物动力学及剂量能有更好的控制，在剂量选择时更有信心，减少与其他药物的相互作用，提高活性并减少剂量，提高专一性并降低由其对映体引起的可能的副作用。

外消旋体的拆分

●利用手性化合物成盐后不同的物理性质

d-2-甲基丁酸作为香料应用已多年，它具有刺鼻辛辣的羊乳干酪样气味和辛辣的味道，当稀释到低浓度时，则具有令人愉快的水果样味道。同时，因它具有右旋光性，还是手性液晶的重要材料。但是从杂醇油中分离、制备的d-2-甲基丁酸往往纯度不够高，因而影响了它的香气，也了它作为液晶原料的使用。常常含有一部分无旋光性的3-甲基丁酸。它们的沸点相近溶解性能相仿，因而用通常方法很难将其分开。用1-麻黄碱与上述二者成盐后再分离的方法。它们的盐在冷水中的溶解度大不相同：d-2-甲基丁酸与1-麻黄碱生成的盐水溶性小，而3-甲基丁酸与1-麻黄碱生成的盐水溶性大。所以可以得到良好的分离效果。

●手性衍生化反应后色谱柱分离

  拆分β-受体阻断剂的柱前手性衍生化试剂已有多种，其中多数是β-受体阻断剂分子中的氨基反应形成氮衍生物，在反相柱上的色谱分离度较差。（R,R）-O，O二乙酰基就是酸酐（DATTAN）可与β-受体阻断剂分子中的羟基反应生成单酯，所形成的非对映异构体衍生物有很好的色谱分离度。而且经色谱拆分后的衍生物可在温和条件下水解为相应的异构体，可制备色谱拆分。以β-受体阻断剂类药物心得安为代表。

Shim-pack CLC-ODS分析柱进行半制备色谱。（R）-心得安衍生物总是先于（S）-心得安衍生物出峰。将拆分后的两种非对映异构体衍生物分别进行水解提纯后，用NOVA-Pak C18分析柱做纯度鉴定，结果，两种光学异构体的纯度均高于９９％。

●高效液相色谱手性固定相法直接分离对映体

高效液相色谱手性固定相法拆分克伦特罗对映体。伦特罗是一种选择性高、作用性强的β2受体激动剂,能解除支气管平滑肌痉挛,而对心血管的影响甚微。它具有起效快、维持时间长、剂量小和毒副作用低的特点,尚有增强呼吸道纤毛运动,作用于溶酶体促进粘痰溶解及抗过敏作用,这有助于提高平喘疗效,临床主要用于支气管哮喘和喘息性支气管炎的治疗等。国内用于无感染的吸入性支气管哮喘,即刻止喘的显效率高达83.5%[2]。最新的研究表明,克伦特罗可以作为外源性药物通过口服或注射途径诱导内源性ＮＧＦ的产生并起到对脑的保护作用,对它的研究为治疗神经退行性疾病和脑卒中开辟了新的广阔前景。克伦特罗分子中含有一个手性中心,可分为(Ｒ )和(Ｓ )两种对映异构体,目前市售该药物主要以外消旋形式存在。在临床应用中发现,如果长期或大剂量服用外消旋药物克伦特罗,其残留部分则会在体内沉积,直接威胁人类健康。虽然克伦特罗在临床使用中出现的副作用与其服用剂量之间的严格关系尚不太清楚,但据文献报道,不同结构对映体将会产生不同的药理活性。所以,克伦特罗的对映体分离对于进一步研究其药理和开发副作用更小的新药有重要的意义。Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相已成功用于多种手性药物的拆分,是当前已商业化的应用最广的手性固定相之一[1,7]。利用Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相于二元流动相条件下,对药物克伦特罗对映体进行了成功拆分。

克伦特罗在固定相上能够较好的拆分,并且容量因子都较小,这与Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相与克伦特罗分子的相互作用相关。克伦特罗对映体在Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相上的分离符合“三点作用”[11]机理,其与固定相之间相互作用情况为:(1)克伦特罗对映体分子上的羟基ＯＨ与手性固定相分子中酰胺部分的羰基ＣＯ之间形成氢键作用;(2)克伦特罗对映体分子上呈弱π 性的苯环与固定相分子中呈较强π 酸性的苯环之间的π π电子转移相互作用;(3)克伦特罗对映体分子中苯环上的氨基ＮＨ2与固定相分子中苯环上的硝基ＮＯ2之间较弱的氢键作用。对于(Ｒ,Ｒ)构型的Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相而言,被拆分的手性化合物的Ｒ 对映异构体在该固定相上保留较强[12],克伦特罗对映体在此固定相上的拆分也满足这一规律。由于克伦特罗的Ｓ 构型对映体分子中的直链氨基烷基与Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相分子中的位阻基团产生了强烈的位阻作用,阻碍了手性识别所需的分子间作用力的形成,减弱了其在手性固定相上的有效吸附,从而被流动相优先洗脱而先出峰;而对于Ｒ 构型对映体分子,由于适宜的空间构型无明显的位阻效应,对映体分子中的羟基ＯＨ与手性固定相分子中的羰基ＣＯ间的氢键作用力容易发生,从而有利于“三点相互作用”的形成,在色谱柱上的保留时间亦相对较长,后出峰。克伦特罗对映体分子与Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相分子间的相互作用如图所示。

　Interaction between Whelk-Ol chiral stationary phase (CSP) and clenbuterol enantiomersａ.Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相与(+) Ｓ 克伦特罗的相互作用ｂ.Ｗｈｅｌｋ Ｏ1手性固定相与(+) Ｒ 克伦特罗的相互作用

●胶束动电毛细管色谱法（MECC）

其最大的特点是使用表面活性剂作为胶束相。目前最常用的是十二烷基硫酸钠（SDS）。在分离手性物质上，SDS无手性活性，还需加入下面一些手性添加剂，与SDS组成具有手性活性的混合胶束。

1．十二烷基—L—丙氨酸 

Cohen等根据配位体交换原理，用十二烷基—L—丙氨酸（SDALa）和SDS混合以Cu离子为中心离子，分力了苏氨酸、蛋氨酸和亮氨酸对应体对。

2．十二酰基—L—缬氨酸 

Dobashi等认为，待分析物与手性胶束的疏水作用是手性识别的基础。用SDVal和SDS混合，拆分了4对二硝基苯（DNB）衍生化的氨基酸外消旋体。

3．环糊精（CD）

   MECC用CD来拆分旋光异构体是胶束研究的一个突破。CD具有中空的圆筒状的立体结构，内部疏水，外部亲水。常见的CD有α、β、γ三种类型，分别由6、7、8个葡萄糖分子组成。若待测物的疏水程度、形状和大小与CD疏水腔相吻合，则可进入到CD腔内部，形成包合物。有由于CD和SDS互不相溶，待测物就可在水、SDS、CD相之间分配。另外，在每个CD的葡萄糖单元分子上有5个手性原子，这是CD能进行手性识别的一个重要因素。由于CD溶解度较低，实际工作中多数用其衍生物。

此外还有胆酸盐、洋地黄毒泔、牛血清白蛋白也可以作为手性添加剂。

●酶催化

生物催化手性拆分是以酶或微生物选择性催化外消旋底物中某个对映体优先反应,再利用其与未反应对映体的物理化学性能差异达到拆分目的。生物催化拆分反应操作简便,选择性强,因而生物催化手性拆分有利于较大规模地制备手性产品,近年来已利用其成功地制备了许多手性药物。

酶催化拆分的常见反应类型：

(1)不对称水解反应

水解酶的结构简单、来源丰富、无须辅酶且许多已商品化,故成为目前酶催化手性拆分中使用最多的生物催化剂。Ｘ射线衍射结果表明[4],脂肪酶的空穴结构可以辨别不同对映体其催化的拆分反应主要为水解、酯化和转酯,如Ｍｏｒｅｎｏ等利用固定化脂肪酶Candida cylindracea lipase (ＣＣＬ)催化萘普生乙酯不对称水解得到95%的(Ｓ)-萘普生。某些水解酶甚至可以催化环氧化物、腈、酰胺的水解。

*环氧化物水解

环氧化物水解酶能催化环氧化物进行不对称水解,与一般酶催化不对称合成反应相比,该类酶以水代替缓冲液作溶剂简化了下游处理过程,因而被誉为“绿色化学”方法。大量研究结果表明,微生物来源的酶,其对映体选择性与底物的取代结构有关,如酵母细胞中红酵母属(Rhodotorula)可催化拆分脂肪族单取代环氧乙烷,真菌细胞中曲霉属(Aspergillus )则选择催化芳香环或杂环单取代环氧乙烷,细菌特别是放线菌(Actinomycete)适用于制备2,2-和2,3-二取代环氧乙烷。例如手性吡啶型环氧乙烷(1)是制备一些手性阻断剂的关键中间体,反应中所用的环氧化物水解酶来源于丝状菌(filamen tousfungi)的黑曲霉(Aspergillusinger)得到2种手性环氧化物,对映体过量≥98%(见图1)。

*腈水解

腈水解酶无须辅酶,催化氰基直接水解成羧基,而腈水合酶具有紧密结合的金属离子(Cｏ或Ｆｅ)作为辅酶,首先催化氰基生成相应的酰胺,再经过酰胺酶或蛋白酶催化水解为羧基。(Ｒ)-α-氟苯乙酸(2)[7]可以由动力学拆分α-氟苯乙腈得到。源于A Thalians的腈水解酶没有按照一般的途径直接将氰基转化为羧酸,而是像腈水合酶一样经过酰胺再到羧酸。(Ｒ)-异构体的氰基水解为羧酸,而(Ｓ)-异构体不发生反应,因而可达到拆分目的(见图2),对(Ｓ)-异构体进行二次拆分可提高原料转化率。

*酰胺水解

氨基酰化酶能选择性催化酰基氨基酸的酰胺键水解,制备Ｄ-氨基酸。目前利用海因酶生产Ｄ-对羟基苯甘氨酸已达相当生产规模。

(2)氧化-还原反应

*氧化反应

酶催化氧化反应手性拆分比传统化学氧化法具有更高的对映体选择性,通常在外消旋环酮的某个对映体的碳环里插入氧分子形成内酯,而另一个对映体不发生氧化反应。图3为选择性氧化仲醇(3)而得到甲基酮和手性仲醇的实例,手性醇是合成一些仿生产品以及药物的中间体。

*还原反应

脱氢酶可以催化醛或酮不对称还原。海生草苔虫bugula neritia (Linnaeus) 和苔藓类植物Amathia conuoluta中的提取物具有抗肿瘤疗效,可以治疗淋巴白血病和卵巢癌,经研究其有效成分是一个大环内酯。仿生合成这一大环内酯的关键步骤在于拆分外消旋体(见图4),采用源于Lactobacillus kefir的乳杆菌属醇脱氢酶,并用聚乙二醇(ＰＥＧ)作为载体,可以提高产物的纯度和产率。

手性氢过氧化物及其衍生物是近年来不对称合成具有氧化能力的化合物的重要中间体。Adam等用从土壤中分离得到的2种微生物细胞催化不对称还原氢过氧化物,克服了酶催化反应需要使用大量的纯化酶,且需要辅酶的缺点(见图5)。

(3)转移-裂合反应

转移酶和裂合酶能催化Ｃ—Ｃ、Ｃ—Ｎ、Ｃ—Ｏ以及ＣＣ、ＣＯ等化学键的生成和裂解反应。磷酸甘油酸激酶的用途是催化天然底物甘油磷酸化,它也可以催化仲醇羟基磷酸化,用于外消旋仲醇的拆分(见图6)。Persson等比较了溶剂、水活度对裂合酶和脂肪酶催化拆分反应的影响,结果表明体系含水量增加,裂合酶催化拆分反应的对映体选择性增加,而脂肪酶催化反应则相反。溶剂极性对裂合酶催化反应影响不大,众所周知,溶剂极性对脂肪酶催化反应则有很大的影响。

(4)非水介质合成反应

*酯合成反应

利用生物催化的酰基转移反应替代直接酯化反应拆分手性醇类旋光异构体,可避免副产物水的影响,常用酰基供体主要有羧酸乙烯酯、异丙烯酯、肟酯或酸酐等。肟酯有较高的反应速率[16]且反应副产物不再参与后继反应,酸酐可使反应不可逆。研究表明,用脂肪酶催化时,一般说来是(Ｒ)-仲醇或(Ｓ)-伯醇优先反应。以手性β-羟基腈为中间体,将氰基转化为氨基或羰基,可以合成手性1,3-氨基醇或1,3-二醇。图7所示反应以乙酸乙烯酯为酰基供体,不稳定的烯醇副产物很快自发转变为稳定的乙醛而有利于反应进行。

呋喃型木酚醇(6)有保肝抗菌以及促进伤口愈合的功能,(2Ｓ,3Ｒ)-(6)的疗效远大于(2Ｒ,3Ｓ)-(6)。传统合成方法须用大量手性助剂,而酶催化酯化有时能同时表达很好的区域和立体选择性而方便廉价,如(6)含有2个醇羟基,脂肪酶区域选择性催化其中一个羟基酯化并同时在另一个羟基上表达出立体选择性(见图8)。

*酰胺化

水解酶在非水介质中能催化酯的氨解合成酰胺或将含氨基的外消旋体酰胺化。文献报道脂肪酶中Candida antarctica lipase (ＣＡＬ)是对酰胺化最有效的酶催化剂。在ＣＡＬ作用下,含有手性碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则,即按手性碳原子上取代基的大小来识别和决定反应的立体构型,而且与氨基相连的碳原子的立体结构对酰胺化反应有很大的影响。

用固定化氨基酰化酶拆分DL-对氯苯丙氨酸。合成和拆分路线如下：

  用固定化米曲霉氨基酰化酶对DL-对氯苯丙氨酸进行光学拆分是一种有效的方法，反应条件温和，分离纯化方便，产品的光学纯度高，可以对化学合成的多种DL-对氯苯丙氨酸进行光学拆分，同时可制得两种（D、L）光学活性产物。该方法克服了直接氯化法反应步骤繁多、氨基酸氧化酶法只得单一L型产品以及蛋白酶法所需底物修饰复杂的缺点，在制备产物时步骤更简便，同时该方法使用的是固定化酶，对于大规模生产十分有利。因此它可作为对化学合成新型氨基酸进行光学拆分的一种新途径。

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