转基因技术在草坪草育种中的应用进展

星，贺春贵*，王森山

（甘肃农业大学草业学院，甘肃

兰州730070）

转基因技术在草坪草育种中的应用进展

摘要：以转基因技术在草坪草育种中的应用进展为研究对象，参考了国内外相关文献，就转基因技术在草坪草育种中的应用进行了简要的概述，并结合我国实际，展望了转基因技术在草坪草育种中的应用前景。

关键词：草坪草；转基因技术；育种中图分类号：S688.4

文献标识码：B

文章编号：1673-8403（2010）04-0020-05

收稿日期：2009-12-15

基金项目：国家“十五”重大科技专项“奶业重大关键技术研究与产业化技术集成示范”课题三“优质饲草高效生产关键技术研究与产业化开发”（BA518A03）资助

作者简介：崔星（1982-），男，甘肃临夏人，在读硕士，研究方向为生物多样性。*通讯作者

草坪草（Turfgrasses ）是指用于草坪建植的禾本

科和少数莎草科植物，约有40种草坪草可用于草坪建植[1]。而草坪业是现代农业的一部分，随着经济的发展和人民生活水平的提高，草坪在城市绿化和环境改善中起着越来越大的作用，城市的草坪覆盖面积及其质量已成为评价其现代化程度的重要标准之一[2]。尽管草坪草有着极强的生态适应能力，但随着草坪应用范围的不断扩大，草坪草的抗逆性、品质等方面显著下降。传统的遗传改良方法很难兼顾抗性和草坪草品质等方面，而用基因工程的方法能有效地解决上述仅

由少数基因控制的性状，兼顾抗性和草坪草品质[3，4]

。

植物基因工程在学者Murai 和Barton 等将外源（细菌）DNA 导入植物细胞后得到了很快的发展。遗传转化最早获得成功的草坪草是果园草[5]，随后高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）[6~8]、红顶草[9]、紫羊茅[10]、翦股颖[11]相继用原生质体融合法获得成功。外源DNA的导入与植物种类、植株再生体系与基因导入技术等有关。目前常见的转化方法有：基因法介导、农杆菌（Agrobacterium spp.）介导、电击融合法介导、硅碳纤维介导、PEG介导的直接基因转化。所有这些系统都是将外源DNA 导入植物细胞或原生质

体，利用细胞的全能性获得转基因植株。本文就草坪

草的遗传转化方法作一综述。1转化方法

1.1基因转化法

基因转化法（微弹轰击法）是用带有目的基因的质粒DNA包裹金粉或钨粉形成微弹，然后利用基因装置将包裹了外源DNA 的微弹加速到300~600m/s 的高速度，穿过植物细胞壁和质膜，送入细胞内，整合到植物的基因组DNA中[12]。此法有效地避免了原生质体再生培养的困难，克服了许多学者认为的农杆菌的宿主，且受体材料来源广泛，可用胚性愈伤组织、悬浮培养物、幼胚、成熟胚或未成熟胚等，同时不受基因型的。因此，此法一经问世就得到许多研究者的青睐。利用此法转化成功的主要是禾谷类作

物[13，14]

，此法也成功应用于草坪草的遗传转化中，如

早熟禾[15~18]、匍匐翦股颖[19，20]

、多年生黑麦草[21]、高

羊茅[22，23]、紫羊茅[24，25]

、多花黑麦草[25]、鸭茅[26~28]都可见相关报道。

此外，基因转化法可转化植物的不同细胞器，如线粒体、叶绿体[29]。目前，它是质体基因工程中最常用和最有效的DNA 导入技术。与核基因相比，质体基因转化具有高效表达、原核基因无需修饰改造、便于遗传操作、可实现定点整合和易保持纯系、后代不分离等优点，显示出旺盛的生命力。另外，质体基因转化的安全性好，外源基因进入质体基因组后，只能进行母系遗传，不像核基因那样可以随花粉而扩散，从而保证了基因工程的安全性[30]，这对于草坪草基因工程具有重大意义。

20

1.2农杆菌介导法

农杆菌已广泛应用于双子叶植物基因工程中的遗传转化，此转化法克服了外源基因序列往往是多拷贝插入，常会导致共抑制与基因的沉默；转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传，再生的植株不育[14]这些缺点，它可以转化完整的可再生的组织和器官[36]，为植物遗传转化提供了一种方便、高效的转化方法。早先的研究人员认为单子叶植物很难用农杆菌侵染，但农杆菌介导转化法随后在水稻、小麦、玉米上成功应用，近年来也在草坪草转基因育种中获得成功。Rosset等人[36]最早报道多年生黑麦草和多花黑麦草被成功转化，标志着农杆菌介导转化法在草坪草遗传转化上的突破。随后，农杆菌介导转化法在匍匐翦股颖[38]、细弱翦股颖[38]、鸭茅[39]、结缕草[40]、狗牙根[41]也获得成功。张磊[41]所在的实验室初步建立了结缕草、高羊茅和白三叶等草坪草的转化体系。利用农杆菌介导转化时，他们认为应充分、合理考虑激素特别是2，4-D。激素2，4-D有利于愈伤组织的诱导，但显著降低分化成苗效果。Khayri等[42]在诱导结缕草分化时，发现分化培养基上不加2，4-D时平均每块愈伤可长出16个小植株，而在浓度为5mg/L、7.5mg/L、10mg/L的2，4-D处理后平均每块愈伤仅长出0.2个小植株。

虽然农杆菌介导转化法在以上几个草种中已有转基因植株，但还存在着对草种的局限性。单子叶植物难以用农杆菌感染的原因[14，44]主要有：一是单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子；二是单子叶植物转化的靶组织或细胞不能进行有效的细菌粘附，无明显的创伤反应，不能诱导创伤附近的细胞脱分化形成大量感受态细胞，而只有那些再生和整合转化能力强的感受态细胞才能得到转化植株。因此，可采取相应措施以提高农杆菌转化草坪草的可能性[14，36]，如选择具分生能力的靶组织或细胞与农杆菌共培养；以乙酰丁香酮等酚类化合物人工处理农杆菌，诱导Vir基因表达；筛选有效的基因型及农杆菌株系。

1.3电击融合法介导

电击融合法介导的直接基因转化，它是用高压放电产生的电脉冲，在原生质体膜上形成可逆性瞬间孔道，促进外源DNA进入细胞的一种转化技术。Ha用电击融合法获得了高羊茅的抗潮霉素的转基因植株，而且他认为看护培养是必需的。Asano报道了电击融合法介导的Agrostis palustris Huds.直接基因转化进展。Asano用电击融合获得了抗除草剂的转基因Agrostis palustris Huds.植株，通过用Ca（NO3）2替代CaCl2，并将电击缓冲液pH值提高到9~10，能有效地提高转化效率。

1.4硅碳纤维介导

碳化硅纤维介导转化法是将细胞或组织的培养物与质粒DNA及搅动着的针状的碳化硅纤维混合，纤维与细胞的摩擦会穿透细胞，DNA就会进入细胞中，实现植物细胞的转化[48，49]。此方法最先由Keappler等在1990年应用于玉米的基因转化中[48]，草坪草转基因育种中应用此方法最早见于Asano等[49]报道转化的小糠草的细胞检测到了GUS表达。至今，碳化硅纤维介导转化的草坪草有小糠草[50]、多花黑麦草[51，52]、多年生黑麦草、高羊茅、匍匐翦股颖[52]。碳化硅纤维介导转化法操作简便、成本低，而且能较好地控制转化的DNA 的数量[36，49]，但也有不足之处：一是转化后细胞的生活力下降；二是目前为止转化的受体细胞只限于悬浮细胞[36，53]，因此这种方法还有待于进一步完善。

Dalton[34]用硅碳纤维介导了多年生黑麦草、高羊茅、匍匐翦股颖和一年生黑麦草的抗潮霉素的转基因植株，但发现对二倍体多年生黑麦草植株的遗传转化较困难。

1.5PEG介导的直接基因转化

1982年Krens等利用PEG的这种特性将Ti质粒的一段T-DNA导入烟草原生质体，首次利用PEG方法

21转化植物原生质体成功。随后利用PEG介导在很多双子叶植物上获得了转基因植株。20世纪80年代中后期，原生质体培养和植株再生在禾本科很多作物上相继获得成功后，PEG法也很快被用于禾谷类作物的外源DNA转移，并获得水稻、小麦、玉米等转基因植株。

Inokuma[53]用PEG法获得了结缕草的抗潮霉素的植株，并用PCR和Southern杂交进行了检验，用Adh1作为启动子的GUS基因得到了高效表达，其愈伤组织起源于茎尖顶端分生组织。

2遗传转化体系的稳定性

为了提高草坪草基因转化的效率，建立高效的再生体系、揭示细胞状态的规律性是必要的。

植株细胞、组织、器官在组织培养过程中，由于培养时间、条件、生长素等影响，易产生体细胞变异，变异的细胞不仅影响植株的分化，而且不利于转基因研究。

在草坪植株再生体系建立的早期，许多学者就发现培养时间过长的愈伤组织、悬浮培养细胞再生成植株的概率明显下降，经细胞学和分子生物学手段分析，认为与培养过程中的体细胞变异有关。Valles用细胞学和分子生物学（RFLP、RAPD）手段分析了从牛尾草（Festuca pratensis Huds.）愈伤组织悬浮培养获得的植株与从原生质体获得的植株在遗传上的稳定性和一致性。Humphreys分析了由高羊茅悬浮培养再生出的植株与原生质体培养再生出的植株在PGI（葡糖异构酶）位点的稳定性，他认为起源于愈伤组织培养再生出的植株在PGI位点的谱带与母株是不同的，而由原生质体再生出的植株在PGI位点的谱带与母株是相同的。

3草坪草转基因研究展望

转基因草坪草的基因来源比较广泛且针对性强，可将特定的目的基因直接转化到需要改良的特定草坪草品种中。此过程所需周期短，省时省力，获得的一些品种能弥补传统育种周期长、效率差的缺陷。在草坪业迅速发展的同时，出现了一些严重影响草坪业的问题，一是草坪杂草防除问题：草坪杂草不仅影响草坪的美观，而且会降低其使用价值，甚至在控制不力的情况下，由于杂草的严重入侵而取代草坪草；二是干旱地的草坪建植问题：干旱胁迫是干旱、半干旱地区草坪草生长的一个主要环境因子，特别是在水比较紧缺的城市地区，草坪灌溉需水是许多城市景观设施中竞争用水的一个重要方面，具有防护功能和美

化作用的高速公路、铁路生物护坡上的草坪建植，往往因不具备灌溉条件以及土质、立地条件差等原因造成草坪建植失败。如果能培育耐除草剂、抗干旱剂和抗干旱的草坪草，这些问题均可得到解决，不仅有利于草坪业的发展，而且有利于我国的生态环境建设。

随着现代分子生物学技术的进步，以bar基因为代表的耐除草剂基因，以脯氨酸合成酶基因、甜菜碱合成酶、调渗蛋白基因为代表的抗旱基因已被克隆，如能将其转入草坪草基因组，并得到表达，经转基因植株生物安全性测试之后，投入生产应用，必将产生巨大的经济效益和社会效益。此外，也可将抗病虫基因、抗衰老基因转入草坪草，增强草坪草的抗病虫能力，延长草坪草的绿色期，使其在园林绿化中发挥更大的生态效益。

转基因技术虽存在一些问题，但已取得了很多成就，获得了一些转基因植株。随着草坪草高效组培再生体系的建立、遗传操作技术的完善及信息传导、基因高效表达等基础研究的发展，以基因转化手段改良草坪草遗传品质具有诱人前景。可以培养出抗旱、耐盐碱、抗病、抗虫等新品种。总之，转基因技术对草坪草的遗传改良发挥着重要作用，是现代草坪草新优品种繁育的主要手段之一，加之与其它生物技术及传统育种方法的有机结合，必将对草坪业的发展产生巨大的推动作用。

参考文献

［1］Duble R L.Turfgrasses：Theirmanagement and use in the southern zone［M］.College Station，U SA：TaxasA&M U

niv.P ress，1996.

［2］张俊卫，包满珠，孙振元.草坪草遗传转化研究进展［J］.林业科学研究，2003，16（1）：⁃94.

［3］何茂泰，于林清.牧草生物技术的研究与实用化前景［J］.生物工程进展，1997，17（2）：63.

［4］江玉林，曹致中.牧草遗传工程研究进展［J］.国外畜牧学—草原与牧草，1998，（2）：59.

［5］Horn ME，Conger BV，Harms CT［J］.Plant Cell Reports，1988，（7）：371⁃374.

［6］Bouchez D，Hofte H［J］.PlantPhysiol，1998，（118）：725⁃732.［7］Sam Lievens，Sofie Goormachtig，Marcelle Holsters［J］.

Nucleic Acids Res，2001，29（17）：3459⁃3468.

［8］Asano Y，Ugaki M［J］.Plant Cell Reports，1994，（13）：243⁃246.［9］Spangenberg G，Wang ZY，Nagel J，et al.Plant Science，1994，（97）：83⁃94.

［10］Lee L，Laramore CL，Day PR，et al.Crop Science，1996，（36）：401⁃406.

22［11］孙敬三，朱志清.植物细胞工程实验技术［M］.北京：化学工业出版社，2006.

［12］Benli Chai，Mariam B Sticklen.Application of biotechnology in turfgrass geneti cimprovement［J］.Crop Science，1998，38

（5）：1320⁃1338.

［13］叶健明，唐克轩，沈大棱.植物基因转移方法概述［J］.生命科学，1999，11（2）：58⁃60.

［14］马忠华，张云芳，徐传祥，陈文峻，尹红华，蒯本科.早熟禾的组织培养和基因介导的基因转化体系的初步建立［J］.

复旦学报（自然科学版），1999，8（5）：540⁃544.

［15］Ke S，Lee C W，Cheng Z M.Genetic transformation of Kentucky bluegrass with rolC gene［J］.Hortscience，1996，

31（4）：616.

［16］HartmanC L，Lee L，Day P R，Chin C K，Zilinska B，Tumer NE.Progress toward stable transformation and

regeneration of creeping bentgrass and Kentucky bluegrass

［J］.In Vitro，1993，29A，3，Pt.2，86A.

［17］Ha C D，Lemaux P G，Ch oMyeongJe，Cho MJ.Stable transformation of a recalcitrant Kentuckybluegrass（Poa

pratensis L.）cultivar using mature seed⁃derived highly

regenerative tissues［J］.In Vitro Cellular and

Developmental Biology Plant，2001，37（1）：6⁃11.

［18］Xiao L，Ha S B.Efficient selection and regeneration of creeping bentgrass transformants following particle

bombardment［J］.Plant Cell Re p.，1997，16（12）：874⁃878.［19］Hartman C L，Lee L，Turner N.Particle gun transformation of creeping bentgrass（Agrostis palustris）［J］.Cell.Biochem.，

1994，Su ppl.18A，101.

［20］Spangenberg G，Wang Z Y，Wu XL，Nagel J，Potrykus I.

Transgenic perennial ryegrass（Lolium perenne）plants from

microprojectile bombardment of embryogenic suspension

cell［J］.Plant Science，1995，108（2）：209⁃217.

［21］Spagengerg G，Wang Z Y，WuX L，Nagel J，Iglesias V A，Portykus I.Transgenic tall fescue（Festuca arundinacea）

and red fescue（F.rubra）plants from microprojectile

bombardment of embryogenic suspension cells［J］.Journal

of Plant Physiology，1995，145（5⁃6）：693⁃701.

［22］Cho M J，Ha C D，Lemaux P G.Production of transgenic tall fescue and red fescue plants by particle bombardment of

mature seed⁃derived highly regenerative tissues［J］.Plant

Cell Reports，2000，19（11）：1084⁃10.

［23］Altpeter F，Xu JianPing，XuJ P.Rapid production of transgenic turfgrass（Festuca rubra L.）plants［J］.Journal

of Plant Physiology，2000，157（4）：441⁃448.

［24］Ye X，Wang Z Y，Wu X，Potrykus I，Spangenberg G.

Transgenic Italian ryegrass（Lolium multiflorum）plants

from microprojectile bombardment of embryogenic

suspension cells［J］.Plant Cell Re ports，1997，16（6）：

379⁃384.

［25］Denchev P D，Songstad D D，McdanielJK，CongerBV.

Transgenic orchardgrass（Dactylis glomerata）plants by

direct embryogenesis from microprojectile bombarded leaf

cells［J］.Plant Cell Reports，1997，16（12）：813⁃819.［26］Madaniel J K，Denchev P D，Songstad D D，CongerB V.

Direct transformation of orchardgrass leaf cells by

microprojectile bombardment［J］.In Vitro，1997，33（3）：

Pt.2，49A.

［27］Nash J L，Conger B V.Long term production of transformed embryos of orchardgrass in suspension culture［J］.In Vitro，

1996，32（3）：Pt2，68A.

［28］叶健明，唐克轩，沈大棱.植物基因转移方法概述［J］.生命科学，1999，11（2）：58⁃60.

［29］侯丙凯，陈正华.高等植物的质体基因转化［J］.生物工程进展，2000，20（1）：70⁃73.

［30］Heleen M，van der Maas，Eliza R，et al.Stable transformation and long term expression of the gusA

reporter gene in callus lines of perennial ryegrass（Lolium

perenne）［J］.Plant Mol Biol，1994，24（2）：401⁃405.［31］Wang G R，Binding H，Posselt UK.Fertile transgenic plants from direct gene transfer to protoplasts of Lolium

perenne and Lolium multiflorium［J］.Plant Physiol，1997，

（151）：83⁃90.

［32］Zhong H，Bolyard MG，Srinivasan C，et al.Transgenic plants of turfgrass（Agrostis palustris）from microjection

bombardment of embryogenic callus［J］.Plant Cell

Reports，1993，12（1）：1⁃6.

［33］Hartman C L，Lee L，Day P R，et al.Herbicide resistant turfgrass（Agrostis palustris）by biolistic transformation［J］.

Biotechnology，1994，（12）：919⁃923.

［34］Dalton S J，Bettany A J E，Timms E，et al.Cotransformed，diploid Lolium perenne，Lolium multiflorum and Lolium

temulentum plants produced by microprojectile

bombardment［J］.Plant Cell Reports，1999，18（9）：721⁃726.［35］Benli Chai，Mariam B Sticklen.Application of biotechnology in turfgrass genetic improvement［J］.Crop

Science，1998，38（5）：1320⁃1338.

［36］Rosselt U K，Wang G，Schubert J，BollerB（ed.），Stadelmann FJ.Induction of virus resistance by means of⁃

mediated gene transfer in ryegrasses A.Breedin g for a

functional agriculture.Proceedings of the21Meeting of the

Fodder Crops and Amenity Grasses Section of EUCARPIA.

Kartause Ittingen，Switzerland;9⁃12September，1997.

1998：154⁃156.

［37］Chai MingLiang，Kalaiselvi K，Mo Sukyoen，

23ChungYoungSoo，Cho SungHyun，Shin Jeongshepo，

Park MiHyea，Kim Doo Hwan.Embryogenic callus

induction and Agrobacterium⁃mediated transformation in

bentgrass（Agrostis spp.）［J］.Journal of the Korean

Society for Horticultural Science，2000，41（5）：450⁃454.［38］Lee Hyoshin，Lee Byung Hyun，Jo Jinki，Lee HS，Jo J K.

Development of transgenic orchardgrass（Datylis glomerata

L.）using A grobacterium tumefaciens［J］.Journal of the

Korean Society of Grassland Science，2000，20（2）：103⁃108.［39］Ge Y X，Norton T，Wang Z Y.Transgeenic zoysisagrass（Zoysia japonica）plants obtained by Agrobacteriummediated

transformation［J］.Plant Cell Rep，2006，（79）：178⁃181.［40］Wang Z Y，Ge Y X.Rapid and efficient production of transgenic bermudagress and creeping bentgrass bypassing

the callus formation phase［J］.Function Plant Biolog，2005，

（32）：769⁃776.

［41］张磊，胡繁荣，沈希宏，等.草坪草生物技术进展研究热点［J］.核农学报，2004，18（5）：372⁃375.

［42］Khayri A L，et al.Plant regeneration of zoysia grass from embryo⁃derived callus［J］.Crop Sci，19，（29）：1324⁃1325.［43］郭殿京，张丽明，孙勇如.禾谷类作物基因工程新进展（综述）［J］.农业生物技术学报，1997，5（4）：360⁃365.

［44］Ha S B，Wu F S，Thorne K.Transgenic turf⁃type tall fescue （Festuca arundinacea）plants regenerated from protoplasts

［J］.Plant Cell Reports，1992，11（12）：601⁃604.

［45］Asano Y，Ugaki M.Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporation⁃mediated direct gene transfer

into protplasts［J］.Plant Cell Reports，1994，13（5）：243⁃246.［46］Asano Y，Ito Y，Fukami M，et al.Herbicide resistant transgenic creeping bentgrass plants obtained by

electroporation using an altered buffer［J］.Plant Cell

Reports，1997，16（12）：874⁃878.

［47］Kaeppler H F，Gu W，Somers D A，Rines H W，Cockburn

A F.Silicon carbide fiber⁃mediated DNA delivery into plant

cells［J］.Plant Cell Rep.，1990，9（8）：415⁃418.

［48］Kaeppler H F，Somers D A，Rines H W，Cockburn A F.

Silicon carbide fiber⁃mediated stable transformation of plant

cells［J］.Theoretical and a pplied Genetics，1992，84（5⁃6）：

560⁃566.

［49］AsanoY，Otsuki Y，Ugaki M.Electroporation⁃mediated and silicon carbidefiber⁃mediated DNA delivery in Agrostis alba

L.（Redtop）［J］.Plant Science，1991，79（2）：247⁃258.［50］DaltonS J，Bettany AJE，Timms E.S ilicon⁃carbide whisker⁃mediated transformation of Lolium［J］.Journal of

Experimental Botany，1995，46（Suppl.）：34.

［51］Dalton S J，Bettany A J E，Timms E，Morris P.Transgenic plants of Lolium multiflorum，Lolium perenne，Festuca

arundinacea and Agrostis stolonifera by silicon carbide fibre⁃

mediated transformation of cell suspension cultures［J］.

Plant Science，1998，132（1）：31⁃43.

［52］Ha S B，Penmetsa R V，Wu F S.Trandgenic espression of the beta⁃glucuronidase gene driven by different5regulatory

sequences in tall fescue protoplasts［J］.Journal of turfgrass

management，1995，1（1）：73⁃81.

［53］Inokuma C，Sugiura K，Imaizumi N，et al.Transgenic Japanese lawngrass（Zoysia japonica）plants regenerated

from protoplasts［J］.Plant Cell Reports，1998，17（5）：334⁃

338.

［54］AsanoY，Ugaki M.Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporation⁃mediated direct gene transfer

into protplasts［J］.Plant Cell Reports，1994，13（5）：243⁃

246.

［55］Ha SB，Wu F S，Thorne K.Transgenic turf⁃type tall fescue （Festuca arundinacea）plants regenerated from protoplasts

［J］.Plant Cell Reports，1992，11（12）：601⁃604.

Progress on Application of Transgenic Technology on Turfgrass Breeding

CUI Xing，HE Chun-Gui*，WANG Sen-shan

（College of Pratacultural Science，Gansu Agriculture University，Lanzhou730070，China）Abstract:Research on transgenic method progress of turfgrass.Looking back related papers from home and abroad，making a brief overview of progress that transgenic method progress of turfgrass.With China's reality，making Prospect of the genetic transformation technology in the area of turfgrasses breeding

Key words:Turfgrass；Transgenic technology；Breeding

24