大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器

1）实验材料：大肠杆菌

2）实验试剂：

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3、溶液配制

1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L，细菌培养用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去离子水。

 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min.)

2）TE缓冲液：

1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）

1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用） 

TE缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml

0.5M EDTA PH =8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）

3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）

4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）      

4、实验方法步骤

1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。

2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液

3、加190 ul TE悬浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠

4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。

5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。

6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min

7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min

8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min

9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min

10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min

11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解

12、溶解于20ul TE中，-20℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。

细菌基因组DNA提取试剂盒：

1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒

DP302-02   50次   420元

2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒

TaKaRa  DV810A  50  650元

3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒

GD2411-01  Bacterial gDNA kit  50次  423元

GD2411-02  Bacterial gDNA kit  250次  1798元

4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒

BSC12S1  50次   400元

 BSC12M1  100次   750元

5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒

D3350-00  E.Z.N.A.TM  Bacterial DNA kit  5    210元

D3350-01  E.Z.N.A.TM  Bacterial DNA kit  50   980 元

D3350-02  E.Z.N.A.TM  Bacterial DNA kit  200  3350元

荧光定量PCR试验（标准曲线法）

定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 （靶）数量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。

【实验原理】

在实时定量实验中，反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产物最终数量来描

述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。

    在 PCR 的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的 PCR 循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度 （与基线循环相对应的 Rn 值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 （ delta Rn [∆Rn] 值）与阈值交叉的点。 ∆Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT。

一、试验设计

使用StepOne软件中的Design Wizard（设计导向）创建新实验

1、定义实验属性

在 Experiment Properties （实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。

1）Experiment Name （实验名称）。

2）Barcode （条码），然后输入您的 PCR 反应板上的条码。（可不填）

3）User Name （用户名）。

4）Comments （注释）。（可不填）

5）选择 Quantitation （定量）实验类型

6）Next> （下一步）

2、定义方法和材料

在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和 PCR 模板。

1）将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。

将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。 标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。 从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。 当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。

用于标准曲线实验的 PCR 反应包括以下组分：

• 样本 － 其中靶数量未知的样本。

• 标准品 － 数量已知的样本。

• 标准品稀释序列 － 一组用于构建标准曲线的标准品稀释液 （例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32） 。

• 重复数 － 含有相同组分和量的相同反应数。

• 阴性对照 － 含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为 “无模板对照

(NTC)”。阴性对照应不会扩增。

2）为试剂选择 TaqMan® Reagents （ TaqMan 试剂）（包括两个引物一个探针） 。

–如果使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择

TaqMan® Reagents （ TaqMan 试剂） 。 TaqMan 试剂包括两个引物和一个

TaqMan® 探针。 引物设计用于扩增靶。 TaqMan 探针设计用于杂交靶，并

在扩增靶时产生荧光信号。

切记！ Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。

–如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选

择 SYBR® Green Reagents （ SYBR Green 试剂）。 SYBR Green 试剂包括两

个引物和 SYBR Green 染料。 引物设计用于扩增靶。 SYBR Green 染料可在

结合到双链 DNA 时产生荧光信号。 SYBR Green 染料通常是添加到反应的

SYBR Green 母液的一部分。 如果使用 SYBR Green 染料：

选择 Include Melt Curve （包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。

将 Standard （标准）选为升降温速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBR

Green 试剂的 Fast 母液。

3）为升降温速度选择 Standard (~2 hours to complete a run) （标准 （约两小时完成运行）） 。

– 如果为 PCR 反应使用 Fast 试剂，则选择 Fast (~40 Minutes to

Complete a Run) （快速 （约 40 分钟完成运行） ）。

 – 如果为 PCR 反应使用标准试剂 （包括 SYBR Green 试剂和 TaqMan 试剂） ，则选择 Standard (~2 Hours to Complete a Run) （标准 （约 2 小时完成运行）） 。

4）为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因组 DNA） ） 。

5）Next> （下一步） 。

3、设置靶

在 Targets （靶）屏幕上，输入您想在 PCR 反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。

1）单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入 1（根据需要填）。

注意： 靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。

2）选择 Set Up Standards （设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。

建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。

注意： Set Up Standards （设置标准品）复选框默认情况下已选取。

3）设置靶 1 检测：

a. 单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 RNase P（示例）。

b. 从 Reporter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认） 。

– 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择FAM。

– 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择JOE。

– 如果要将 VIC® 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5′ 端，则选择VIC。

– 如果您正使用 SYBR® Green 染料以检测双链 DNA，则选择 SYBR。

c. 从 Quencher （淬火基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认） 。

– 如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的 TaqMan 探针的 3′ 端，则选择 NFQ-MGB。

– 如果您正使用 SYBR Green 染料，则选择 None （无） 。

4）Next> （下一步） 。

4、设置标准品

在 Standards （标准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。

1）单击 How many points do you need for each standard curve? （每条标准曲线您需要多少个点？）字段，然后输入 5。

建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。

2）单击 How many replicates do you need for each point? （每个点您需要多少次重复反应？）字段，然后输入 3。

建议每个点三次重复反应。

3）为 RNase P （示例）检测定义标准品数量范围：

a. 单击 Enter Starting Quantity （输入起始量）字段，然后输入 10000。

由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当范围：

– 为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到 5 个至6 个对数级之间。 如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用 PCR 产物或高度浓缩的模板，如 cDNA 克隆。

– 如果您的 cDNA 模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。

b. 从 Select Serial Factor （选择序列倍数）下列菜单中，选择 1:2。

序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。 如果您的起始数量是最高数

量，则选择如 1:2、 1:3 之类的稀释倍数。 如果您的起始数量是最低数量，则选择如 2X、 3X 之类的浓缩倍数。

4）查看 Standard Curve Preview （标准品曲线预览）窗格。 标准曲线应包含如下点：10000、 5000、 2500、 1250 和 625。

5）Next> （下一步） 。

5、设置样本

在 Samples （样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性对照数，然后选择样本/靶反应以进行设置。

1）单击 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入 2。（根据需要填）

2）单击 How many replicates do you need? （您需要多少次重复反应？）字段，然后输入 3。

建议对每个样本反应重复三次反应。

3）单击 How many negative controls do you need for each target assay? （每个靶检测您需要多少阴性对照？） ，然后输入 3。

建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。

4）4. 设置样本 1：

a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 pop1 （用于重复组 1） 。

b. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。

5）设置样本 2：

a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 pop2 （用于重复组 2） 。

b. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。

6）选择 All Sample/Target Reactions （所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。

– 选择 All Sample/Target Reactions （所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。

– 选择 Specify Sample/Target Reactions （指定样本/靶反应）以指定每个样本中要检测的靶。

7）在 Well Count （反应孔数）窗格中，确认存在：

• 6 个未知反应孔U

• 15 个标准品反应孔S

• 3 个阴性对照反应孔N

• 24 个空反应孔

8）在 View Plate Layout （查看检测板布局）选项卡上：

a. 从 Arrange Plate by （反应板布局方式）下拉菜单中，选择 Rows （按行）

（默认） 。

b. 从 Place Negative Controls （放置阴性对照）下拉菜单中，选择 Upper Left（左上角） （默认） 。

9）Next> （下一步） 。

6、设置运行方式

在 Run Method （运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体积和温度变化过程设置。 若需要，您可调整默认运行方法或用 Run Method （运行方法）库中的某种方法进行替换。

1）单击选择 Graphical View （图形视图）选项卡 （默认）或 Tabular View （表格视图）选项卡。

2）单击 Reaction Volume Per Well （每个反应孔的反应体积）字段，然后输入 25 µL。

为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系统支持 10 至

30 µL 之间的反应体积。

3）确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。

– 确保温度变化过程设置适合试剂。

– 如果正执行一步法 RT-PCR 扩增，则包括一个反转录步骤。

如果实验需要一个不同的温度变化过程设置，调整温度变化过程设置或用

Run Method （运行方法）库中的某个温度变化过程设置进行替换。 Run Method（运行方法）库包括在 StepOne 软件中。

4）Next> （下一步） 。

7、查看反应设置

在 Reaction Setup （反应设置）屏幕上，选择检测类型 （如果使用 TaqMan 试剂），然后查看为准备 PCR 反应、标准稀释序列和样本稀释而计算的剂量。 若需要，您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。

切记！ 对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。

完成 Reaction Mix Calculations （反应预混液计算）选项卡

1）选择 Reaction Mix Calculations （反应预混液计算）选项卡 （默认）。 

2）从 Select Target （选择靶）窗格中，选择 RNase P。

3）从 Assay Type （检测类型）下拉菜单中，选择 Inventoried/Made to Order（库存/定制） 。

如果正使用 TaqMan 试剂，选择所使用的检测类型：

– 如果正使用 Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays （库存/定制）或 Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression Assays，则

选择 Inventoried/Made to Order （库存/定制）。

– 如果正使用 Primer Express® 软件设计检测，则选择 Custom

（定制）。

4）确认 Reaction Volume Per Well （每个反应孔的反应体积）字段中显示 25 µL。

为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系统支持 10 至

30 µL 之间的反应体积。

5）确认 Excess Reaction Volume （额外反应体积）字段中显示 10%。

包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。建议至少准备 10% 的额外反应体积。

6）在 Reactions for RNase P （ RNase P 反应）窗格中：

a. 确认 Master Mix Concentration （母液浓度）字段中显示 2.0X。

b. 确认 Assay Mix Concentration （检测预混液浓度）字段中显示 20.0X。

c. 查看 PCR 反应的组分和计算的剂量。

7）在 Standard Dilution Series for RNase P （ RNase P 的标准品稀释序列）窗格中：

a. 单击 Standard Concentration in Stock （储液中标准品的浓度）字段，然后输入 20000。

b. 单击 units （单位）字段，然后输入 copies per µL。

c. 查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。

完成 Sample Dilution Calculations （样本稀释计算）选项卡

1）选择 Sample Dilution Calculations （样本稀释计算）选项卡。

2）单击 Diluted Sample Concentration (10X for Reaction Mix) （稀释后样本浓度）（对于反应预混液为 10X） ，然后输入 6.6。

3）从单位下拉菜单中，选择 ng/µL （默认） 。

4）查看为样本稀释计算的剂量。

8、实验材料订购

在 Materials List （材料列表）屏幕上，查看建议用于准备 PCR 反应板的材料列表。或者，您可从 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 产品仓库）订购所建议的材料。 创建购物篮，向购物列表中添加项目，然后登录以提交您的订单。 您必须具有不受的网络连接才能访问 Applied Biosystems Store （ AppliedBiosystems 产品仓库） 。

1）在 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 产品仓库）网站上查找靶检测套件：

a. 确保您的计算机已连接到因特网。

b. 单击 Enter Gene Name（输入基因名）字段，输入 RNase P，然后单击 FindAssay （查找检测套件） 。

c. 在 Find Assay Results （发现检测套件结果）对话框中，选择您的检测套件。

d. 单击 Apply Assay Selection （应用检测套件选择） 。

2）完成 Experiment Materials List （实验材料列表）窗格：

a. 从 Display （显示）下拉菜单中，选择 All Items （所有项） （默认） ，然后查看建议的材料。 若需要，使用右侧的滚动条查看所有项。

3）用于进行定量实验的Inventoried/Made to Order 检测设计用于配合以下 TaqMan® 母液使用：

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG，

250 次反应，编号4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix， 200 次反应，编号4304437

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix， 2000 次反应，编号4326708

10 包装 TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix，编号4305719

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG，200 次反应，编号4324018

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG，

2000 次反应，编号4326614

10 包装 TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix， No AmpErase®

UNG，编号4324020

4）靶DNA 或 cDNA有几种 TaqMan 和 SYBR Green 试剂可用于定量实验。

a.TaqMan® 试剂

 TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No

AmpErase® UNG， 250 次反应4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix， 200 次反应，编号4304437

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix， 2000 次反应，编号4326708

10 包装 TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix ，编号4305719

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No，AmpErase® UNG， 200 次反应，编号4324018

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, NoAmpErase® UNG， 2000 次反应，编号4326614

10 包装 TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix，No AmpErase® UNG，

编号4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit， 200 次反应，编号N808-0228

b.SYBR® Green 试剂

Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL)，40 次反应，编号4368577

Power SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL)，200 次反应，编号4367659

Power SYBR® Green PCR Master Mix(10 × 5-mL)， 2000 次反应，编号4368708

Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL)，2000 次反应，编号4367660

SYBR® Green PCR Master Mix (1-mL)， 40 次反应，编号4344463

SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL)， 200 次反应，编号4309155

SYBR® Green PCR Master Mix (50-mL)， 2000 次反应，编号4334973

SYBR® Green PCR Core Reagents， 200 次反应，编号4304886

9、完成设计向导

        要完成 Design Wizard （设计向导）工作流程，查看反应板布局，然后选择一个退出选项。

1）在 Review Plate for Experiment （查看实验的反应板）窗口中，查看反应板布局。

2）单击 Save Experiment （保存实验） 。

3）在 Save Experiment （保存实验）对话框中，单击 Save （保存）以接受默认文件名和位置。 示例实验被保存并关闭，并且您返回到 Home （主页）屏幕。

二、准备反应工作

如何为标准曲线实验准备 PCR 反应。

1、准备样本稀释

在将样本添加到最终反应预混液之前，执行样本稀释。采用 StepOneTM 软件计算的剂量稀释样本。（样本稀释计算）

根据储液中的样品浓度？ng/µL，Stepone软件计算出稀释剂量。因为在 StepOne 软件中，样本量仅限于反应总量的 10%，因此需要进行样本稀释。 反应总量为每次反应 25 µL，因此样本量为每次反应 2.5 µL。根据 “样本稀释计算”表稀释样本。

1）所需材料

  用于稀释样本的稀释液（TE缓冲液或水）、样本储液

  微量离心管、移液、移液头、试管振荡器、离心机

2）为每份拟稀释样本标记一个单独的微量离心管：Population 1、 Population 2等

3）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内。（14.2µL）

4）将所需剂量的样本储液添加到每个反应管内。（1µL）

5）振荡每份稀释的样本 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

6）将稀释后样本置于冰上，直到准备好反应板。

2、准备标准品稀释序列

       采用 StepOne 软件计算的剂量准备标准品稀释序列。（反应预混液计算）根据储液中的标准品浓度？copies/µL，Stepone软件计算出剂量。

1）所需材料

用于稀释标准品的稀释液（TE缓冲液或水）、标准品储液

 微量离心管、移液、移液头、试管振荡器、离心机

2）为每份标准品标记一个单独的微量离心管：Std. 1、Std. 2、Std.3、Std. 4、Std. 5。

3）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内：Std. 1（14.5µL）、Std. 2（9.1µL）、Std.3（9.1µL）、Std. 4（9.1µL）、Std. 5（9.1µL）。

4）在Std. 1 反应管中准备稀释液 1：

a. 振荡储液 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

b. 使用新的移液头，将 3.6 µL 储液添加到Std. 1 反应管中。

c. 振荡 Std. 1 反应管 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

5） 在Std. 2 反应管中准备稀释液 2：

a. 使用新的移液头，将 9.1 µL 稀释液 1 添加到Std. 2 反应管中。

b. 振荡 Std. 2 反应管 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

6）在Std. 3 反应管中准备稀释液 3：

a. 使用新的移液头，将 9.1 µL 稀释液 2 添加到Std. 3 反应管中。

b. 振荡 Std. 3 反应管 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

7）在Std. 4 反应管中准备稀释液 4：

a. 使用新的移液头，将 9.1 µL 稀释液 3 添加到Std. 4 反应管中。

b. 振荡 Std. 4 反应管 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

8）在Std. 5 反应管中准备稀释液 5：

a. 使用新的移液头，将 9.1 µL 稀释液 4 添加到Std. 5 反应管中。

b. 振荡 Std. 5 反应管 3 至 5 秒，然后短暂地离心反应管。

9）将标准品置于冰上，直到准备好反应板。

3、准备反应预混液

使用 StepOne 软件计算的组分和剂量准备反应预混液。（反应预混液计算）

若实验包括一个以上的靶检测，则为每个靶检测单独准备反应预混液

1）所需材料

各反应预混液组分

微量离心管、移液、移液头、离心机

2）为反应预混液标记一个适当大小的反应管： Reaction Mix。

3）将所需剂量的每种组分添加到反应管中：母液（2.0X）12.5µL、检测母液（20.0X）1.3µL、水8.8µL，总剂量22.6µL，加上10%的超额量2.26µL，共计24.86µL，24次反应所需剂量为596.6µL

注意：将检测母液置于冰柜中避光储存，直到准备使用。 过多暴露在光线下会影响荧光探针。

计算中包括额外剂量，以便为试剂转移期间发生的损失提供多余剂

量。建议至少准备 10% 的超额量。

4）用移液轻轻吸入并排出反应预混液使其混合，然后盖上反应管盖。

5）短暂地离心反应管以除去气泡。

6）将反应预混液置于冰上，直到准备好反应板。

注意：使用之前，请执行以下操作：

– 摇晃瓶子，彻底混合母液。

– 振荡反应管以重新悬浮检测母液，然后短暂地离心反应管。

– 将任何冷冻样本置于冰上将其解冻。 解冻时，进行振荡以重新悬浮样本，

然后短暂地离心反应管。

4、准备反应板

为每个重复组准备反应物，然后将它们转移到反应板。 采用 StepOne 软件中显示的反应板布局。 

1）所需材料

反应预混液Reaction Mix、标准品、样本、水

MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate

 MicroAmpTM Optical 48-Well Adhesive Film

微量离心管、移液、移液头、离心机

2）准备靶阴性对照反应预混液：

a. 向一个适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和水。

c. 短暂地离心反应管以除去气泡。

d. 向反应板的相应反应孔中分别加入 25 µL 的阴性对照反应预混液。

3）对于每个重复组，准备标准品反应预混液：

a. 向适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和标准品。

c. 短暂地离心各反应管以除去气泡。

d. 向反应板的相应反应孔中加入 25 µL 的标准品反应预混液。

4）对于每个重复组，准备未知样本的反应预混液：

a. 向适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和样本。

c. 短暂地离心各反应管以除去气泡。

d. 向反应板的相应反应孔中加入 25 µL 的未知 （样本）反应预混液。

5） 用孔板高透光度盖膜密封反应板。

6） 短暂地离心反应板以除去气泡。

7） 在您准备好运行实验之前，将反应板置于阴暗处的冰上。

注意：当您准备自己的标准曲线实验时：

• 确保您使用适当的耗材。

• 确保 PCR 反应的安排与 StepOne 软件中显示的反应板布局一致。 您可以：

– 接受软件自动生成的反应板布局。

或

– 使用 Advanced Setup （高级设置）工作流程更改软件中的反应板布局。

三、运行试验

1、准备运行

       打开实验并将密封的 MicroAmpTM Fast Optical 48-Well Reaction Plate 装载到StepOneTM 扩增仪以准备运行。

      1） 打开设计的实验

a.打开StepOne

b.从Home屏幕上，单击Open

c.在Open对话框中，导航到experiments文件夹（默认）

d.找到创建的试验设计，打开。

2）装载反应板（带无粉手套）

a.打开扩增仪抽屉

b.将反应载体放置在样本加热块中。反应板的方向取决于您所用耗材的类型：

• 若使用一个反应板，让 A1 反应孔位于样本加热块的左后角。

• 若使用反应管条带，则将条带置于样本加热块中。

c. 小心地关闭扩增仪抽屉。

2、启动运行

若计算机已通过 StepOne 系统线缆直接连接到 StepOne 扩增仪，则执行下列步骤。（并置启动）

1）在 StepOne 软件中，单击 Temperature Plot （温度曲线） 。

2）单击 START RUN （启动运行） 。

3、监视运行

        1）并置监视

运行期间，定期查看 StepOne 软件提供的所有三条曲线是否存在潜在问题。

a.停止运行

在 StepOne 软件中，单击 STOP RUN （停止运行）。对话框中包括：

– Stop Immediately （立即停止）以立即停止运行。

– Stop after Current Cycle/Hold （当前循环 / 保持阶段后停止）以在当前循环或保持阶段之后停止运行。

– Cancel （取消）以继续运行。

b. 实时查看扩增数据

Amplification Plot （扩增曲线）屏幕允许在 StepOne 扩增仪运行期间采集荧光数据时查看样本扩增。 若设置了某种方法以采集实时数据， Amplification Plot（扩增曲线）屏幕上会显示在 View Plate Layout （查看反应板布局）选项卡中所选反应孔的数据。 扩增曲线将对照归一化染料荧光 (∆Rn) 循环数。

Amplification Plot （扩增曲线）屏幕对识别和检查异常扩增十分有用。 异常扩增可能包括以下情况：

• 阴性对照反应孔中荧光增强。

• 预期循环中不存在可检测荧光 （在相同情况下使用相同试剂从先前类似的实验运行确定） 。

c. 实时查看运行的温度数据。

运行期间， Temperature Plot （温度曲线）屏幕上实时显示样本加热块、受热护盖门和样本 （已计算）的温度。

Temperature Plot （温度曲线）屏幕对识别硬件故障十分有用。 当监视 TemperaturePlot （温度曲线）屏幕时，观察 Sample （样本） 、 Heated Cover （受热护盖门）和 Sample Block （样本加热块）曲线是否出现异常情况。

• 通常， Sample （样本）和 Block （样本加热块）曲线应大约相互对应。 两条曲线存在显著偏差可能表示存在问题。

• Heated Cover （受热护盖门）曲线应保持方法中指定的常温。 偏离一致温度可能表示存在问题。

d. 在 Run Method （运行方法）屏幕上查看运行进度

开始运行之后， StepOne 系统会在 Run Method （运行方法）屏幕上显示运行进度。例如对于方法的温度变化过程报告运行进度。

更改运行方法 （添加循环、保持或解链曲线）

• 在导航窗格中，单击 Run Method （运行方法） 。

• 在 Run Method （运行方法）屏幕上，执行以下任意操作

– 输入要应用于 Cycling Stage （循环阶段）的循环数。

– 若您想要将解链曲线阶段添加到运行的末尾，则选择

Add Melt Curve Stage to End（将解链曲线阶段添加到末尾） 。

– 若您想要将保持阶段添加到运行的末尾，则选择 Add

Holding Stage to End （将保持阶段添加到末尾）。

• 单击 Send to Instrument （发送到扩增仪）

e. 启用/禁用通知设置。

取或取消选取 Enable Notifications （启用通知）复选框。

2）远程监视

        若将您的 StepOne 扩增仪连接到网络，您可使用 StepOne 软件的远程监视功能从网络上的任何一台计算机上实时查看运行进度。

4、卸载反应板并传输数据

当StepOne 扩增仪显示 Run History （运行历史）屏幕时，从 StepOne 扩增仪上卸载反应板，并将实验数据传输到计算机以进行分析。

当 StepOne 扩增仪完成一次运行时，系统会将运行详情保存到运行历史

记录，在扩增仪完成另一次运行之前，该运行历史记录会保留在系统中。

1）当 StepOne 扩增仪触摸屏上显示 Run Report （运行报告）屏幕时

2）打开扩增仪抽屉。

3）从样本加热块中取出反应板。

4） 小心地关闭扩增仪抽屉。

切记！ 不要在运行后关闭 StepOne 扩增仪电源开关。 不使用时，扩增仪会自动进入休眠模式。

并置数据的传输是自动传输。

四、实验分析

StepOneTM 软件使用标准曲线定量方法分析实验数据。

1、实验数据

打开StepOne，从Home屏幕上，单击Open，在对话框中，导航到experiments文件夹，找到创建的试验设计，打开实验数据文件，单击Analyze （分析） ， 软件使用默认分析设置来分析数据。

1）软件元素 

a.Experiment Menu （实验菜单）窗格 － 提供到以下软件屏幕的链接：

• Setup （设置）屏幕

• Run （运行）屏幕

• Analysis （分析）屏幕：

–Amplification Plot （扩增曲线）

–Standard Curve （标准曲线）

–Multicomponent Plot （多组分曲线）

–Raw Data Plot （原始数据曲线）

–QC Summary （ QC 摘要）

–Multiple Plots View （多曲线视图）

b.  Plot （曲线）窗格 － 为已打开的实验显示所选分析屏幕。

c. View （视图）选项卡 － 为已打开的实验显示反应板布局或反应孔表

d. Experiment （实验）选项卡 － 为每个打开的实验显示一个选项卡。

2）如何选择反应孔

要在分析屏幕上显示特定反应孔，在 View Plate Layout （查看反应板布局）选项卡上选择相应的反应孔，操作如下：

a. 要选择某特定类型的反应孔，使用 Select Wells With （选择反应孔类型）下拉菜单： 选择 Sample （样本） 、 Target （靶）或 Task （任务） ，然后选择样本、靶或任务名称。

b. 要选择单个反应孔，在反应板布局中单击该反应孔。

c. 要选择多个反应孔，按住 CTRL 键并单击、或按住 Shift 键并单击反应板布局中的某反应孔并拖移鼠标覆盖所需的反应孔。

d. 要选择所有 48个反应孔，单击反应板布局的左上角。

3）如何显示多条曲线

使用 Multiple Plots （多曲线）屏幕可同时显示最多 4 条曲线。 要在 Multiple Plots（多曲线）屏幕内导航：

a. 从 Experiment Menu （实验菜单）窗格中，选择 Analysis （分析）→

Multiple Plots View （多曲线视图） 。

b. 要显示四条曲线，单击∷ Show plots in a 2 × 2 matrix （以 2×2 窗格方式显示曲线） 。

c. 要在两行中显示两条曲线，单击∶ Show plots in two rows （以两行显示曲线） 。

d. 要在两列中显示两条曲线，单击‥ Show plots in two columns （以两列显示曲线） 。

e. 要显示某特定曲线，从每条曲线显示上方的下拉菜单中选择该曲线。

2、查看标准曲线

Standard Curve （标准曲线）屏幕显示指定为标准品的样本的标准曲线。 StepOne软件根据标准曲线计算未知靶的数量。在 Standard Curve （标准曲线）屏幕上检查以下回归系数值：

• Slope （斜率） /扩增效率

斜率/扩增效率值 － 扩增效率通过使用标准曲线中回归线的斜率来计算。

斜率接近 −3.3 表示最佳，即 100% PCR 扩增效率。 影响扩增效率的因素包括：

– 标准品数量范围 ，为了获得更准确及更精确的效率测量值，使用大范围的标准品数量 （ 5 至 6 个对数级 （ 105 至 106 倍） 。

– 标准品重复数 ，为了获得更准确的效率测量值，包括重复数以降低移液误差的影响。

– PCR抑制剂 － 反应中的 PCR 抑制剂可降低扩增效率。

• R2 值 （相关系数）

R2 值表示标准曲线回归线与标准反应的单个 CT 数据点之间的拟合程度。 值 1.00 表示回归线与数据点完全拟合。 R2 值 >0.99 较理想。

• CT 值

阈值循环 (CT) 是荧光水平达到阈值时的 PCR 循环数。 CT 值 >8 且

<35 较理想。 CT 值 <8 表明反应中有太多模板。 CT 值 >35 表明反应中靶的数

量太少；对于 CT值 >35 的情况，期望更高的标准偏差。

1）从 Experiment Menu （实验菜单）窗格中，选择 Analysis （分析） 

Standard Curve （标准曲线） 。

注意： 如果 Standard Curve （标准曲线）屏幕中未显示数据，单击 Analyze（分析）。

2） 在 View Plate Layout （查看反应板布局）选项卡上单击反应板布局的左上角，以在 Standard Curve （标准曲线）屏幕上显示全部 48 个反应孔。

3）从 Target （靶）下拉菜单中，选择 All （全部） 。

4）从 Plot Color （曲线颜色）下拉菜单中，选择 Default （默认） 。

5）单击 Show/Hide the plot legend （显示/隐藏曲线图例） 。

6） 查看标准曲线下面显示的值。 在示例实验中，靶 (RNase P) 的值在可接受范围之内：

– 斜率为 −3.4。

– R2 值为 1。

– 扩增效率 (Eff%) 为 94.376%。

7） 检查所有样本均在标准曲线内。 在示例实验中，所有样本 （蓝点）均在标准曲线（红点）内。

8）检查 CT 值：

a. 单击 View Well Table （查看反应孔表）选项卡。

b. 从 Group By （分类方式）下拉菜单中，选择 Replicate （重复） 。

c. 查看 CT 列中的值。 在示例实验中， CT 值在预期范围 （ >8 且 <35）内。

3、查看扩增曲线

①Amplification Plot （扩增曲线）屏幕上显示所选反应孔内所有样本的扩增情况。有三种曲线可供选择：

• ∆Rn 随循环变化 － ∆Rn 是 PCR 运行生成的归一化荧光信号的量值，且是计算 CT 所依据的数据。 此曲线将 ∆Rn 作为循环数的一个函数显示。 您可通过此曲线来识别并检查不规则扩增，并查看运行的阈值和基线值。

• Rn 随循环变化 － Rn 是归一化报告荧光染料。 此曲线将 Rn 作为循环数的一个函数显示。 您可通过此图来识别和检查不规则扩增。

• CT 随反应孔变化 － 阈值循环 (CT) 是荧光水平达到阈值时的 PCR 循环数。 此曲线将阈值循环 (CT) 作为反应孔位置的函数显示。 您可使用此曲线查找异常扩增 （异常值） 。

每条曲线可采用图形方式查看： 线性或 log10。

②可在 Amplification Plot （扩增曲线）屏幕上查看靶，以检查：

• 正确的基线值和阈值

正确的基线值和阈值 － StepOne 软件自动计算基线值和阈值 （基于数据显示典型扩增曲线的假定） 。典型扩增曲线包含：

a. 平台期

b. 线性期

c. 指数级增长期 （几何级增长期）

d. 背景

e. 基线。

切记！ 实验性错误 （如污染物或移液错误）可产生非典型扩增曲线，从而导致 StepOne 软件计算出错误的基线值和阈值。 因此，建议在分析完成后检查 Amplification Plot （扩增曲线）屏幕，并查看为每个反应孔指定的基线值和阈值。

• 异常值

如果您的实验不符合上述指南，则进行下列故障排除：

- 手动调整基线和/或阈值 

- 忽略反应孔

1）从 Experiment Menu （实验菜单）窗格中，选择 Analysis （分析）Amplification Plot （扩增曲线） 。

注意： 如果 Amplification Plot （扩增曲线）屏幕上未显示数据，单击

Analyze （分析） 。

2）在 Amplification Plot （扩增曲线）屏幕上显示 RNase P（示例） 反应孔：

a. 单击 View Plate Layout （查看反应板布局）选项卡。

b. 从 Select Wells With （选择反应孔）下拉菜单中，选择 Target （靶） ，然后选择 RNase P（示例）。

3）在 Amplification Plot （扩增曲线）屏幕上：

a. 从 Plot Type （曲线类型）下拉菜单中，选择 ∆Rn vs Cycle （ ∆Rn 随循环变化） 。

b. 从 Color Plot By （标记曲线颜色方式）下拉菜单中，选择 Well （按反

应孔） 。

c. 单击 Show/Hide the plot legend （显示/隐藏曲线图例） 。

4）查看基线值：

a. 从 Graph Type （图形类型）下拉菜单中，选择 Linear （线性） 。

b. 选择 Baseline （基线）复选框，以显示开始循环和结束循环。

c. 检查并确认基线设置正确。 在示例实验中，基线在扩增开始之前设置。

5）查看阈值：

a. 从 Graph Type （图形类型）下拉菜单中，选择 Log （对数） 。

b. 从 Target dropdown （靶）下拉菜单中，选择 RNase P。

c. 选择 Threshold （阈值）复选框以显示阈值。

d. 检查并确认阈值设置正确。 在示例实验中，阈值位于指数级扩增阶段。

6）查找任何异常值：

a. 从 Plot Type （曲线类型）下拉菜单中，选择 CT vs Well （ CT 随反应孔变化） 。

b. 查找其值偏离扩增曲线的反应孔。 在示例实验中，无 RNase P 异常值。

4、查看反应孔表

Well Table （反应孔表）显示反应板中每个反应孔的数据，包括：

• 样本名称、靶名称、任务和染料

• 计算的阈值循环 (CT) 值、归一化荧光 (Rn) 值和量值

• 注释

• 标记

查看反应孔表以检查：

• 数量值

• 标记

• CT 值 （包括 CT 标准偏差）

1）从 Experiment Menu （实验菜单）窗格中，选择 Analysis （分析） ，然后选择View Well Table （查看反应孔表）选项卡。

注意： 如果反应孔表中未显示数据，单击 Analyze （分析）。

2）使用 （分类方式）下拉菜单，以按特定类别将反应孔分类。将反应孔按重复、标记或 CT 值分类。(注意： 一次只能选择一个类别)

a. 从 Group By （分类方式）下拉菜单中，选择 Replicate （重复） 。 软件将重复反应的反应孔分为： 阴性对照、标准品和样本。请注意每个重复反应组内的数量相同。

Replicate （重复） － 软件按重复反应将反应孔分为： 阴性对照、标准品和样本。 查看 Quantity （数量）列以确保每个重复反应组的数量值相同。 这表明严格的精确度。

b. 从 Group By （分类方式）下拉菜单中，选择 Flag （标记） 。 软件将反应孔分为标记反应孔和未标记反应孔。无标记反应孔。

Flag （标记） － 软件将反应孔分为标记反应孔和未标记反应孔。 标记表示软件已在标记反应孔内找到错误。

c. 从 Group By （分类方式）下拉菜单中，选择 CT。 软件将反应孔按 CT 值分为： 低、中、高和未确定。

CT － 阈值循环 (CT) 是荧光水平达到阈值时的 PCR 循环数。 CT 值 >8 且 <35较理想。 CT 值 <8 表明反应中有太多模板。 CT 值 >35 表明反应中靶的数量太少；对于 CT 值 >35 的情况，期望更高的标准偏差。

5、公布数据

可以下列几种方式公布实验数据：

• 将曲线另存为图像文件

• 打印曲线

• 打印反应板布局

• 创建幻灯片

• 打印报告

• 导出数据