细菌DNA提取方法比较

河南省新乡县人民医院(453731)　崔兴杰　史百川　张雅惠

　　摘要　目的:观察凝血酶治疗新生儿消化道出血的疗效。方法:凝血酶200u溶于生理盐水5～10ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用3～5次。结果:显效22例,有效8例,无效1例,总有效率9618%。结论:应用凝血酶治疗新生儿消化道出血,疗效显著,治疗未出现严重的不良反应。

关键词　凝血酶　新生儿消化道出血

　　新生儿消化道出血是一种儿科常见且严重危及新生儿生命的疾病之一,我科自1999年3月～2002年3月三年间,应用凝血酶治疗新生儿消化道出血31例,取得满意效果,现报告如下:

1　临床资料

111　一般资料:本组均为住院病例,31例中男17例,女14例,足月顺产新生儿5例,早产17例,低出生体重儿6例,难产儿5例,原发病为新生儿窒息10例,缺氧缺血性脑病5例,颅内出血3例,胎粪吸入综合征7例,首发消化道出血6例,呕血,排柏油样便7例,伴休克及全身衰竭1例,血红蛋白均降低,最低达63g/L,血小板<100×109/L10例,凝血时间(玻片法)>6min2例,凝血酶原时间>22s2例。

112　方法及结果

全部病例均给予静脉注射维生素K1,出血量大或重度贫血者予以输血,在上述治疗的同时,给予凝血酶200u溶于生理盐水5～10ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用3～5次。

113　疗效评定标准:①显效:连用3～5次后,未再呕血,大便从柏油样转为黄色或从暗红色转为柏油样;②有效:连用3～5次后,呕血减少,原排暗红色血便改排柏油样便,持续2天以上者,或显效后再发少量出血,按原方案治疗后,达显效者;

③无效:连用3～5次后,未达到有效标准或加剧者。31例中,显效22例,有效8例,无效死亡1例。总有效率9618%,治疗中未发现毒副反应。

2　讨论

新生儿消化道出血是一种常见病,尤其在早产儿,低出生体重儿和各种危重病患儿更易发生,因为这些新生儿血小板破坏增加而致血小板减少,或因维生素K依赖性凝血因子缺乏,或因血管壁薄弱,脆性高,易于损伤,容易引起消化道出血。再者危重病患儿易发生消化道溃疡而致消化道出血。

凝血酶是一种局部止血药,它在接触出血病灶后会形成条索状凝固膜,有收敛作用和促滑肌收缩,降低毛细血管通透性,减轻局部水肿,起止血作用,同时它能直接作用于纤维蛋白原,促进溶胶状态的纤维蛋白原迅速生成不溶性纤维蛋白,堵塞出血点,它还能促进血小板发生不可逆性聚集,并释放血小板因子Ⅲ、Ⅳ、ADP及血栓收缩蛋白增加因子Ⅴ、Ⅷ的活性,激活因子Ⅻ活化,使疏松的纤维蛋白凝块变成紧密的纤维蛋白块,起加固止血作用。

所以,凝血酶对新生儿各种原因引起的消化道出血有确切可靠的止血作用,并且无毒副作用,值得推广应用。

(收稿日期:2003-12-02)

细菌DNA提取方法比较

第153中心医院儿科(郑州　450042)　沈德新　封志纯▲　杜　江▲

　　摘要　目的:比较细菌DNA4种提取方法的优缺点。方法:采用水煮法、传统法、G enmiction DNA K it法、E.ZNA法分别制备18种细菌DNA,比较4种方法提取DNA纯度及量的差异。结果:4种方法制备的DNA均可成功应用于PCR 扩增,水煮法与E.ZNA法提取DNA量都较大,但前者纯度低于后者;G enmiction DNA K it法提取DNA纯度高,但量较低;传统法提取的DNA量及纯度均较低,但经济、可靠。结论:4种方法各具特点,应根据实验目的选用。

关键词　细菌　DNA提取

　　细菌DNA分子水平诊断是临床医学发展趋势。目前,细菌DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同,本文对四种不同DNA提取方法进行比较,旨在为合理选取DNA提取方法提供指导。

1　材料与方法

111　材料

11111　菌株来源:18种菌株,其中金黄色葡萄球菌26112、A TCC27154,绿脓假单胞菌A TCC27316、A TCC27853,产气肠杆菌45103,阴沟肠杆菌45301,大肠埃希氏菌A TCC 25922、44106、肺炎克雷伯氏菌A TCC10031,肺炎链球菌31126,表皮葡萄球菌26069,乙型溶血性链球菌32210,费劳地枸橼酸杆菌48008,婴儿沙门氏菌50204,流感嗜血杆菌NCTC 7279,粪链球菌A TCC14506,葡萄球菌26103等17株购自北京药品生物制品检定所,金黄色葡萄球菌A TCC25923购自中山医科大学微生物室。

11112　主要试剂:溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、平衡重蒸酚、Tris、SDS(均购自华美公司,为分析纯);EDTA、丙酮、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、无水乙醇(均为广州市化学试剂厂生产的分析纯),G enomic DNA K it(Fermentas公司生产),E.ZNA kit (Omega公司生产),100bpMarker(申能),DNA扩增试剂盒

及TaqDNA 多聚酶(购自欧瑞卡)。

11113　主要仪器:梯度PCR 扩增仪(德国Biometra 公司

产品),紫外分光光度计(Beckman DU -520),TG L -16G 台式高速离心机(医用分析仪器厂生产),凝胶图像分析仪(GEL

DOC1000,BIO -RAD 公司产品),紫外透射仪(天能科技公司

生产),H6微型电泳槽,电热恒温水浴锅C 286型,-20℃冰箱。

11114　引物设计:通过Internetd 检索在G enebank 中所有

常见细菌16SrRNA 的基因序列,利用dnastar 软件设计一对细菌的共同引物:上游:5’tcctacgggaggcagcagt3’下游:5’tggac 2

taccagggtatctaatc3’由上海生物工程公司合成。PCR 扩增片段

大小为468bp.

112　方法

11211　细菌DNA 提取:取含118×108菌的菌液加入115ml 的离心管中7500rpm/min 离心5min ,弃上清。

1121111　水煮法[1]:革兰氏阴性杆菌沉淀加入016ml 无

菌去离子水,振荡混匀,100℃水浴10min 后离心,上清作为

DNA 模板-20℃保存备用。革兰氏阳性菌及革兰氏阴性球菌

沉淀加入800ul 丙酮后混均,放入-20℃冰箱中冰浴10min ,

7500rpm/min 离心5min ,弃上清,沉淀在室温下放置5min ,使

丙酮蒸发干。再加入TE 100ul 、10mg/ml 溶菌酶100ul ,37℃温育20min ,离心,沉淀加入TE600ul 重悬,再加入15mg/ml 蛋白酶K25ul ,55℃温育1h 后煮10min ,离心,上清作为DNA 模板

-20℃保存备用。

11

21112　传统法[2]:细菌沉淀加入TE567ul 重悬,加入10%SDS 30ul 和20mg/ml 蛋白酶K 3ul ,于37℃温育1h ,加入5mol/L NaCl 100ul ,CTAB/NaCl 80ul 溶液,于65℃温育10min ,

加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心5min 。上清液转入一个新管加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5min ,上清液再转入一只新管中,加入016体积异丙醇,轻轻混合,离心5min ,弃上清,加入70%乙醇洗涤1min ,离心,弃上清,将沉淀的DNA 溶于100ul 的去离子水中,-20℃保存备用。

1121113　G enomic DNA K it 方法:TE 200ul 重悬细菌沉

淀,加入试剂盒提供的lysis solution 400ul 65℃孵育5min ,加入氯仿600ul ,混均,离心2min ,上清转入事先准备好的加入消毒去离子水720ul 及试剂盒提供的precipitation solution 80ul 新的离心管,室温下放置2min ,离心2min ,弃上清,再加入试剂盒提供的112M Nacl S olution100ul 及冷乙醇300ul ,-20℃放置

10min ,离心4min ,弃上清,去离子水100ul 溶解DNA ,-20℃保

存备用。

1121114　E.ZNA K it 法:TE100ul 重悬细菌,革兰氏阴性

细菌加入10mg/ml 溶菌酶,革兰氏阳性细菌加入100mg/ml 溶菌酶,30℃孵育10min 后离心,弃上清。用试剂盒中提供的

Buffer B TL 200ul 重悬细菌,加15mg/ml 蛋白酶K 25ul ,55℃水

浴1h ,加入试剂盒提供的Buffer BDL 220ul ,70℃水浴10min ,加入无水乙醇220ul ,混均,转入试剂盒提供的Hibind 自旋柱内,自旋柱装入新的2ml 离心管内,离心1min ,弃离心管,柱子重新装入新的2ml 离心管中,加DNA Wash Buffer750ul 于柱中,离心1min ,弃离心管。把柱子置于115ml 离心管中,并加入70℃预热的去离子水200ul ,柱子在室温下放置1min ,离心1min ,收集从柱子上洗脱的DNA ,重复上一步,共收集DNA 溶液400ul ,

-20℃保存备用。

11212　DNA 纯度、质量检测:取细菌DNA 20ul ,TE 稀释

至100ul ,在紫外分光光度计下测量A260nm 、A280nm OD 值,计算DNA 纯度、质量。

11213　细菌DNA 扩增:将上述4种方法提取的细菌DNA

作为模板加入总体积为50ul 的反应体系中:5×butter 10ul ,2.5

mmol/L dN TP ,5uM 上游引物5ul ,5uM 下游引物5ul ,DNA 模

板8ul ,Taq 酶115u ,加去离子水至50ul ,混均。95℃变性5min ,

30个循环94℃40s ,55℃30s ,72℃40s ;最后一个循环72℃延

伸5min 。取8ul PCR 反应产物,115%琼脂糖凝胶(60V )电泳

40min ,置紫外透射仪下观察DNA 特异性条带。

113　统计学处理:采用SPSS1010软件进行完全随机设计

的方差分析,各组间两两均数的比较用Drnnett ’s 法。

2　结果

211　4种方法提取的细菌DNA 量和纯度分析结果见表1。

表1　4种方法提取细菌DNA 纯度和产量比较

　方法细菌样本数

(N )

纯度(OD260/280)

(X ±SD )

产量(ugDNA/107菌)

(X ±SD )

水煮法18 1.70±0.10△□241.92±22.353△□传统法

18 1.72±0.13△□35.88±9.72○□G enomic DNA K it 法18 1.87±0.103○27.88±19.09○□E.ZNA kit

18

1.94±0.063○

106.41±92.523△○

注:3与传统法比P <0105,△与G enomic DNA kit 法比P <0105,○与水煮法比P <0105,□与E.ZNAkit 比P <0105。

212　细菌DNA 扩增:4种方法均扩增出468bp 目的基因,

扩增效果见图1,PCR 产物无拖带与杂带,得到满意的扩增效果。

图1　细菌DNA 为模板PCR 扩增产物电泳结果

注:DNA 模板:1、5、9、13为金色葡萄球菌ATCC 27154,2、6、10、14为绿脓假单胞菌ATCC 27316,3、7、11、15为肺炎克雷伯氏菌ATCC

10031,4、8、12、16为肺炎链球菌31126;DNA 提取方法:1～4为E.ZNA kit 法,5～8为G enomic DNA K it 法,9～12为传统法,13～16

为水煮法;17为100bpMarker

213　4种方法提取细菌DNA 的步骤、时间、费用见表2。

表2　4种方法所用的步骤、平均时间、成本费比较

水煮法

传统法G enomic DNA K it 法

EZN.A K it

步骤数1～47512时间(min )15～1201203090成本(元/份)

015

215

15

10

3　讨论

细菌DNA 提取方法有多种,不同的方法提取的量及纯度不同,所需要的时间及经费也有差别,而不同实验应用的目的要求也各异。比较4种方法优缺点,为合理选择DNA 的提取方法提供指导。

4种方法制备的DNA 均成功应用于PCR 扩增,扩增产物

传统法是目前最常用最可靠的DNA提取方法,所需费用低,但操作繁琐,耗时长,DNA损失量大,产率低,且有污染和毒性作用。与G enomic DNA K it法和E.ZN A kit法相比,传统法提取的DNA纯度显著降低(P<0105),但所提取的DNA可满足临床各种检测需要。传统法适用于初学者或经费有限的实验室。

G enomic DNA K it法操作简便,整个提取过程仅半小时,提取的DNA纯度虽不及E.ZN ARit法,但显著高于水煮法、传统法(P<0105)。该法提取的DNA量较少,费用昂贵,不适于大量标本处理。

E.ZNA kit法是利用Hibind基质这种新型硅基材料可逆结合的特点[3],结合迷你柱旋转分离技术,再加上一套特别配方的缓冲液系统,使细菌DNA结合到基质上,最后用无菌去离子水洗脱出来。E.ZNA法代表一种新的DNA提取方法,避免了苯酚、氯仿对人体的伤害,提取的DNA量大,提取的纯度高,与其它方法比较有显著性差异(P<0105)。该法所得的DNA 可用于测序、酶切、连接、转化、PCR、文库筛选等。但该法操作繁琐,耗时,操作过程中有时会出现蛋白酶消化不完全所致柱子阻塞现象,导致DNA提取量下降或提取失败,适量的蛋白酶及充分温育,可避免此现象。

上述4种方法各有其特点,实际应用中采用何种方法应根据实验对模板DNA浓度、纯度具体要求及实验室条件、经费状况等具体情况来选择。

注:封志纯▲　杜　江▲　广州第一军医大学珠江医院儿科

参考文献

1　苏应斌1莫道君,戴天力1改进的PCR模板制备及DNA回收方法1湖北医科大学学报,1997,18(1):24～25

2　F1奥斯伯等著,颜子颖,王海林译1精编分子生物学实验指南1北京:科学出版社,2001139

3　Tian H,Huhmer AFR,Landers J P.Evaluation of silica resins for direct and efficient extraction of DNA from complex biological Matrices in a miniaturized format.Anal Biothem,2000,283(2):175～191

(收稿日期:2003-10-19)

190例泪道激光治疗泪道阻塞的体会

河南省上蔡县人民医院(463800)　赵　敏　曹治民

　　摘要　目的:体会泪道激光治疗泪道阻塞的方法和效果。方法:选择190例患者(230眼),其中泪小管阻塞20例,泪总管阻塞126例,鼻泪管阻塞23例,鼻泪管吻合18例,外伤性鼻骨骨折3例,经泪道激光治疗,随访18个月。结果:一次性治愈200眼,再次激光治愈20眼,鼻泪管吻合失败1眼,鼻骨骨折1例,治愈率9615%。结论:泪道激光治疗泪道阻塞,对切口周围组织损伤最小,不出血,无瘢痕,不影响美观,无并发症。

关键词　泪道激光　泪道阻塞

　　我院于2001年起应用脉冲Nd:Y A G激光泪道治疗机治疗泪道阻塞,鼻泪管吻合术失败的治疗等190例,效果满意,现报告如下:

1　资料和方法

111　一般资料:本组190例(230眼),男28例,女162例,年龄14～72岁,平均年龄43岁。病程3月～12年,平均315年。泪小管阻塞20例,泪总管阻塞126例,鼻泪管阻塞23例,鼻泪管吻合18例,外伤性鼻骨骨折3例。

112　仪器设备:①带有导光纤维的国产脉冲Nd:Y A G激光治疗机,波长110mm,激光工作频率:1～100Hz,平均输出功率015～30W,引导光,半导体激光。②特制空芯泪道探针,由9号腰椎穿刺针制成,前端圆钝,带有针芯。

113　手术方法:①患者取仰卧位,坐位亦可,用015%地卡因做泪小点表面麻醉,必要时做中鼻甲区粘膜麻醉,特别敏感者可用2%利多卡因做滑车神经及眶下神经麻醉。②扩张泪小点,正常泪小点开口仅012～013mm,泪道探针是不能插入的,在做泪道激光手术时,可用泪点扩张器扩张到1mm。③先用光纤直接插入泪道,探明阻塞部位,激光击射。对鼻泪管阻塞,将带有针芯泪道探针按常规泪道探通法进入泪道,到阻塞处拔出针芯插入光纤击射,至阻力消除并有落空感后,用生理盐水冲洗是否通畅。通畅后,停留15～20min,再注入庆大霉素+地塞米松,泪道注入0125%金霉素眼膏,眼膏粘度大,停留时间长,又具有抗炎、消肿作用。④全身口服少量抗菌药物,局部应用含激素的抗菌眼液点眼,呋吗合剂滴鼻,术后第三天首次冲洗泪道,注入庆大霉素+地塞米松,再注入眼膏,连续两次或者三次注入眼膏,一般治疗1个月或1个半月,治愈率9615%。

114　结果:治愈标准,无溢泪、溢脓、冲洗通畅。本组随访18个月,在190例(230眼)中,一次性治愈200眼,再次激光治疗20眼,鼻泪管吻合失败1眼,鼻骨骨折1眼,其余未继续激光治疗。

2　讨论

以往泪道阻塞都是用手术方法治疗,痛苦大,出血多,损伤面积大。对青年患者来说,又影响美观。而泪道激光治疗机仅用很小的能量就能使组织气化而清除腔内阻塞物,恢复泪道通畅,不会对实质性组织加热,对周围组织,无明显热效应及凝固作用。周围组织损伤小,易于恢复泪道的管状结构。因此,成功率高,操作简单,无瘢痕,痛苦小,无并发症,无需住院,是目前治疗泪道疾病的理想方法。注意事项主要是防止假道形成。

(收稿日期:2003-12-02)