大肠杆菌转基因体系建立和植物基因组提取

                                                        学院：生命科学学院

                                                        专业年级：生技093

                                                        姓名：殷晓杰

                                                        学好：2009013452

大肠杆菌转基因体系的建立和植物基因组的提取

摘要：分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高通量测序，从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验技术的飞速革新和发展。分子生物学成了生命科学研究的基础手段和先进前沿，转基因就是热点之一。本文先是对转基因技术作了一个简单的综述，然后主要是描述了实验室大肠杆菌转基因体系的建立和检测方法。实验材料是含p38质粒的大肠杆菌（实验室命名）和TOP10大肠杆菌（用于制备感受态细胞），最后的检测方法是用的经典的southern bloting。另外，本文最后还简述了植物基因组的提取方法。

关键词  大肠杆菌 转基因体系  植物 基因组提取

前言  分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高通量测序，从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验技术的飞速革新和发展。分子生物学已然成了生命科学研究的基础手段和先进前沿，转基因就是热点之一。

所谓的转基因技术，是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的一种实验技术。转基因技术一般可分为目的基因的获得、粘性末端切割和载体的构建及转导这几个过程。按照目的基因受体的不通过可以把转基因技术分为植物转基因技术和动物转基因技术，还有细菌转基因技术。对于植物转基因技术转化方法目前已经得到了很好的发展，基本上可以分成三类：载体介导的基因转化（如农杆菌介导法和病毒介导法）、DNA 直接导入法（如基因法、PEG 法、脂质体法、电激法、显微注射法、激光微束法、超声波法等）和种质系统介导的基因转化（如花粉管通道法、浸泡法和子房、胚囊注射法等）[1]。转基因动物的制作方法有显微注射法、逆转录病毒感染胚胎法、精子载体法、卵母细胞精子注射法、ES细胞介导的基因转移法及人工酵母染色体法等[2]。对于微生物转基因技术目的基因的转导，可以通过制备感受态细胞改变细胞的通透性来实现。

目前，转基因技术是一个非常热门的研究技术，应用的也是十分普遍，同基因工程、细胞工程紧密联系在一起。转基因的应用和研究热点，有以下几个方面：

1.遗传育种  传统育种只能在同种或亲缘关系很近的物种之间进行，且自发性突变作为选种的前提，其发生机率相当低。转基因技术则可克服上述问题。通过生物信息学以及分子生物学的方法，预测并获得一定优越性的基因，通过转基因技术获得具有该优良性状新的物种或者改良物种，是转基因技术一个热门的研究方向。现在已经的到了蓬勃的发展，并且还将继续火热下去。

2.研究模型的建立  利用转基因技术，可以很好的建立生命科学研究的实验室研究的生物模型。例如，现代医学研究证明人类的大多数疾病都与遗传有关，适当的动物模型对研究基因突变而引起遗传疾病的发病机制是十分有效的。而用转基因动物的方法生产人类遗传疾病模型则成为人类遗传疾病研究的一个极为有效的途径[3]。

3.生物反应器的研究  利用转基因受体生产转入基因的产物是转基因技术的另一个重要应用。在动物上，乳腺反应器就是一个较为成功的例子。发酵工程用的菌很多的也是转基因菌，获得的产物有些则是转入目的基因所表达的[3]。

4.转基因安全性研究  近年来转基因生物安全性问题已引起了公众的普遍担忧, 严重制约了转基因技术成果的推广应用。很多研究者从转基因安全性的角度，对转基因技术进行了深入的探究，开发出了许多安全转基因技术。比如：无选择性标记基因技术、安全标记基因技术、叶绿体转化技术、终止子技术、雄性不育技术、外源基因删除技术。其中外源基因删除技术表现出很大的应用前景[4]。

综上是转基因技术的一个简单的介绍。可以看出转基因技术的科研价值的重要性和应用的普遍性。本次实验旨在建立一个实验室内的大肠杆菌的转基因实验体系，同时涉及到了植物转基因技术的准备实验—植物基因组的提取及体外扩增。

实验材料、试剂、仪器

1.实验材料

1.1.1  细菌培养：

（1）LB培养基（提前配好），酵母提取液，氯化钠，琼脂粉，氢氧化钠（1M╱L）,抗生素（氨苄青霉素）

1.1.2  质粒DNA提取:

LB液体培养基，LB平板培养基，溶液Ι：50mmol／L葡萄糖，10mmol／LEDTA,25mmolTris-Cl(PH8.0),    溶液Π：0.2mmol／LNaoH, 1％SDS,溶液3：ph4.8的醋酸钾溶液（5mol／L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）,TE缓冲液（ph8.0）:10mmol／LTris-HCl,1mmol／LEDTA,无水乙醇，70％乙醇。

1.1.3  琼脂糖凝胶电泳：

DNA样品，TEB缓冲液（5×用时需稀释10倍）点样缓冲液Loading Buffer(10×):0.25％溴酚蓝，40％甘油，溴乙啶染色液（EB）：10mg／ml溴乙啶（致癌小心），琼脂糖

1.1.4质粒DNA酶切及电泳分析：

EcoRΙ酶，λDNA,TEB缓冲液（5×，用时稀释10倍），点样缓冲液loading Buffer (同上)，溴乙啶染色液（EB），琼脂糖。

1.1.5  聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：

TapDNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2）,Dntp,引物（P1，P2）溴乙啶染色液，点样缓冲液

1.1.6  质粒载体和外源DNA的连接反应：

目标DNA片段（RT-PCR扩增产物），载体（Pgemt-easy载体 2×ligation缓冲液，T4DNA连接酶，ddH2O

1.1.7  感受态细胞的制备及转化：

0.1mol／LCaCl2取20ulPCR产物进行1.2％琼脂糖电泳分析，LB液体培养基（见前面），氨苄青霉素（100mg／ml）

1.1.8  DNA分析——Southern杂交：

Standard buffer ,Standard buffer＋50％formamide,High SDS buffer ,Wash SolutionΙ:2×SSC,0.1％SDS,Wash SolutionΠ:0.5×SSC,0.1％SDS

1.2.1  植物基因组DNA提取，酶切及电泳分析：

DNA extraction:500ml（31.885g sorbitol,6.05g Tris ph8.2），Nuclei Lysis buffer:500ml(1M Tris ph7.5 100ml, 0.25M EDTA 100ml , 5M NaCl 200ml , CTAB 10g , ddH2O 100ml),5％sarkosyl(N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml.使用时将上述的三种溶液按1:1:0.4比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g／l）,65℃预热，即为抽提液

1.2.2  RNA提取及纯化：

DEPC，DEPC处理的ddH2O,RNA提取液（每100ml中含有）：Tris 6.06g , LiCl 6.03g   EDTA 10ml  SDS 50g ;  8MLiCl:33.92g LiCl 溶于100mlDEPC，水饱和酚，氯仿，0.5M NaCl, 溴乙啶，点样缓冲液

1.2.3  RT-PCR扩增目的基因才cDNA:

RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，Dntp  ,AMV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶， 10×PCR缓冲液，引物（p1,p2）

2.实验仪器

（1）培养皿，（2）带帽试管，（3）涂布器，（4）高温灭菌锅，（5）无菌操作台，（5）恒温摇床（SKY---211C,made in China），（6）10,100,1000ul移液，（7）台式高速离心机（eppendorf ,5417R ,made in Geramany），（8）摇床（同上），（9）电泳仪DYY——7C型，北京六一仪器厂），（10）微波炉（LG品牌），（11）恒温水浴箱（DK——4208型，上海精宏实）,（12）PCR扩增仪(GeneAmp  9700,made in Singapore)，（13）凝胶成像系统，（14） 1.5ml离心管，（15）离心管架，（16）杂交炉

3.实验材料

含P38质粒的大肠杆菌  大肠杆菌TOP10　黄化干旱胁迫处理的小麦幼苗

实验流程

1.整体实验流程结构图

(1)大肠杆菌转基因体系的建立

整体实验方案流程见下图１，具体实验操作后面将叙述。

(2)植物基因组的提取和体外扩增

基本而言，植物是我们转基因技术应用的热点，所以设计了下面的植物基因组的提取和体外扩增实验。

图２．植物ＤＮＡ提取和ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ扩增

＊：图１中的直线表示理论上对于目的基因的检测应该是对转入目的基因后的大肠杆菌而言的。

2.具体操作方法

１．１细菌培养

母菌活化３７度过夜培养，然后挑取单克隆扩大培养（３７度，２２０转每分钟，８－９小时）

1.２质粒提取和ＰＣＲ

质粒的提取采用的是碱裂解法，参看《分子克隆实验指南》。

ＰＣＲ体系如下：                        PCR程序如下：

电泳检测：点样8ul样+2ul louding buffer，电压：120V恒压。用的是1%琼脂糖胶。

1.3质粒酶切和电泳检测  

Plasmid     10µL

      EcoRI       1µL

      10×buffer   2µL

      ddH2O      7µL

实验酶切体系：20ul体系            

过夜反应。

电泳检测：如上。

1．4质粒载体连接

P38质粒的PCR产物和商业化载体（Pgemt-easy载体）连接。

20ul连接体系：

Buffer（10×）   1ul

PCR片段产物    5ul

Reacptor         1ul

T4-ligase         11ul

ddH2O           2ul

过夜培养。

1.5感受态细胞的制备及转化  1.6克隆和蓝白斑删选

感受态细胞的制备，实用氯化钙对细胞壁进行处理改变其通透性。经典实验参看《分子克隆实验指南》

转化：

42℃热激90s

迅速冰浴

1.7southern 杂交

依据质粒PCR产物合成的地高辛探针，杂交对象是质粒酶切产物。

具体操作参看《分子克隆实验指南》。

2.1植物DNA的提取、PCR及电泳检测

植物DNA提取采用液氮研磨CTAB抽提法，具体操作参看《分子克隆实验指南》。

电泳检测：同上。

PCR程序：

 94℃  3min

                 94℃  45s

 35cycles         55℃  45s

                 72℃  60s

                 72℃  10min

2.2植物RNA的提取和cDNA的扩增

RNA提取采用试剂盒提取法。提取方法参看Trizol试剂盒说明书。

CDNA扩增PCR：

扩增体系：                                        

体系：10µL

 酶          1µL                     

      RNase       1µL

      buffer       4µL

      ddH2O      1µL

      dNTP       2µL

      Oligo       1µL

PCR程序：    

 94℃  3min

                 94℃  45s

 35cycles         55℃  45s

                 72℃  60s

               72℃  10min

电泳检测：0.8%琼脂糖胶。点样类上。

实验结果

1.质粒DNA

2.酶切DNA

Picture 1

Picture 2

3.质粒PCR

4.小麦基因组

5.小麦RNA

6.小麦cDNA

7.杂交转膜

8.southern 杂交显色结果

分析和讨论

1.对于质粒的提取电泳结果而言，质粒在提取过程中发生了开环解旋或者断裂相结果显示出现了多条带。这里要说的是就是不能迷信课本，认为只会出现三条带，而是要具体问题具体分析。虽然有了质粒的损伤，但只要我们酶切的目的片段完整，对后续的实验不会有太大的影响。

2.对于酶切的电泳结果，可谓是一波三折。其中picture1最后在正确情况下跑出来的结果。Picture2是在高浓度的缓冲液下电泳结果，发现画面粘稠，跑的不开。而且，在电泳的一开始的时候正负极也弄反了。这一点是对细节的忽视，这是最大的教训和收获。另外，只对电泳结果而言，除了右边的marker其余条带跑的并不清楚。在该出现的地方，没有明显的亮的条带而且条带过长。初步谈论认为是电流过大，同时由于连续跑电泳，导致缓冲液不纯净也有一定的影响。

3.对于小麦的基因组而言，条带过多，这应该是和小麦六倍体有关的。而且跑出来的也比较模糊，位置不明显，应该是有杂质干扰。

4.对于质粒pCR结果而言，条带清晰，位置明朗，算是比较成功的。

5.对于小麦ＲＮＡ而言，条带很多，这说明提取的时候有干扰，纯化不完全，同时ＲＮＡ也发生了降解。

６．ｃＤＮＡ电泳显示克隆的还是比较好的，同样在恰当的位置出现了条带。

７．对与ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交而言，结果非常好，作为一个经典实验技术，做成功也不足为奇了。只是在操作过程中对于细节的把握不到位。

参考文献