细菌、真菌DNA提取方法的总结

细菌DNA的提取：

（一）

试剂：

1. 抽提缓冲液

2% CTAB (W/V)

2% PVP K25 (w/v) （去色素）

100mM Tris-HCl (pH8.0)

25mM EDTA (pH8.0)

2.0M NaCl

2.10M LiCl

3. 2M LiCl

4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）

5. 3M NaAc (pH5.2)

6. 96% 乙醇

7. 70% 乙醇

步骤：

1.抽提缓冲液65℃预热；

2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；

3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；

4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min； 

5. 取上清，重复4步骤；

6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C沉淀；

11. 离心12,000rpm，10min；

12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

(二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法）

1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA的提取：

（一）

1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

2.加入4mL提取液，快速振荡混匀

3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）

4.1000rpm，4℃，5min

5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）

6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中

8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr

9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min） 

10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用

DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，

3M NaAc 

（二）

1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次

3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min

4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）

5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min

6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中

7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr

8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min） 

9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。