细胞生物学实验指导(终)

黄石理工学院医学院

微生物免疫学教研室

2009年4月

前言

《细胞生物学》实验课的目的，主要在于进行细胞生物学基本技能的训练，验证部分基本原理，培养科学思维方法、学习作风以及分析问题和解决问题的能力。细胞生物学是从显微水平、超微水平和分子水平等三个层次研究细胞结构、功能、代谢等的一门学科。细胞生物学是药学本科生的专业一门重要基础课程。

    为适应目前教学工作的需要，培养实用型人才，提高学生的动手能力，在院系的组织支持下，在全体编者的共同努力下，完成了这本细胞生物学实验指导，希望能借此提高学生的实验课质量，有助于学生对基本理论、基本知识和基本技能的掌握。本实验指导根据医药院校对本科生的教学要求，遵循适用性、科学性和启发性的原则，从实验目的、实验原理、实验材料、实验方法、实验结果等方面入手，较为系统地介绍了细胞生物学的实验内容和基本实验技术。根据本课程内容分掌握和了解部分的两级要求，重点突出，详细编写了验证性实验、综合性实验和选择设计性实验内容，力求实用、简明、清晰。便于学生在有限的时间内抓住重点加深对理论知识的理解，掌握相应的基本技能，培养和训练手脑并用、学会发现问题、思索问题并启发学生解决问题，培养学生养成实事求是和科学求真的好习惯。本实验指导在编写过程中，借鉴了其他大学的实习指导，在此向编写实习指导的作者表示诚挚的感谢！ 

本实验指导适用于药学本科专业和相应专业实验教学使用。

由于编者水平有限，以及编写时间较仓促，实验指导中难免存在缺点和不足，不当之处敬请老师和同学们不吝指正。我们将在今后的教学工作中不断加以补充和完善。

编者

2009年7月

病原生物学和免疫学的教学要求和方法    2

实验一      3

细胞膜的通透性观察

实验二      6

线粒体的超活染色与观察

实验三      8

细胞内过氧化酶的显示

实验四      10

酸性磷酸酶的显示方法 

实验五      12

  细胞骨架系统的显示与观察

实验一  细胞膜的通透性观察

一、实验目的

1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

2.了解溶血现象及其发生机制。

二、实验原理

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

三、实验用品

  (一) 材料   绵羊血细胞

（二）器材   普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架，2ml 注射器（无需针头）或5ml 移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。

（三）试剂

1．Alsever 溶液

葡萄糖                                                2.05g

柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O)                              0.g

柠檬酸（C6H 6O7.H2O）                                 0.05g

氯化钠                                                0.42g

蒸馏水                                                100ml

调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。

2.  0.128 mol/L NaCl 溶液。

3． 0.05 mol/L NaCl 溶液。

4． 0.4 mol/L NaCl 溶液。

3.  0.128 mol/L NH4Cl 溶液。

4.  0.128 mol/L NH4AC溶液。

5.  0.128 mol/L NaNO3溶液。

7.  0.32 mol/L 葡萄糖。

8.  0.32 mol/L 甘油。

9.  0.32 mol/L 乙醇。

10. 0.32 mol/L 丙酮。

11. 蒸馏水。

四、实验操作

1．从购买绵羊血取5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。

2. 使用前，取用Alsever’s 液保存的新鲜血5ml ， 加入8ml 的0.128 mol/L 的NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3 次洗涤，最后配成30%的红细胞（CRBC）悬液。

3. 取11 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。

五、观察结果

1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。

2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。

3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。

六、实验建议

1. 血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。

2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；

3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。

七、实验报告及作业

表4-1 各种溶液的溶血现象观察结果

  编号       测试溶液               是否溶血         时间             分析原因

1      0.128 mol/L NaCl

2      0.05 mol/L NaCl

3      0.4 mol/L NaCl

4      0.128 mol/L NaNO3

5      0.128 mol/L NH4Cl

6      0.128 mol/L NH4AC

7      0.32 mol/L 甘油

8      0.32 mol/L 乙醇

9      0.32 mol/L 丙酮

10     0.32 mol/L 葡萄糖

11     H2O

书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表。

目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－

实验二  线粒体的超活染色与观察

一、实验目的

1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。

2. 学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

三、实验用品

（一）材料    肝细胞、人口腔上皮细胞、

（二）器材     显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

（三）试剂

1．Ringer 溶液

氯化钠                                      0.85g

氯化钾                                      0.25g

氯化钙                                      0.03g

蒸馏水                                      100ml

2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）

称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。

3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）

取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。

四、实验操作

1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2 滴詹纳斯绿B 应用染液。

(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。

(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

2. 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察

(1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

(2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加詹纳绿B 应用液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体表面可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。

(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

(4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。

3. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察

(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。

(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

五、实验报告及作业

绘制口腔上皮细胞、小白鼠肝细胞中线粒体的形态与分布

实验三 细胞内过氧化酶的显示

【 目的要求 】

1、了解显示细胞内过氧化酶的方法的原理。

2、熟悉过氧化物酶在细胞中的一般分布。

【 实验原理 】

细胞中存在的过氧化物酶系能将许多胺类氧化成有色化合物。例如联苯胺便可被细胞中的过氧化酶氧化成蓝色或棕色的物质（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙），从而显示出细胞内过氧化物酶的存在和分布。另外，细胞的代谢过程中会产生对机体有害的过氧化氢（H2O2），可被细胞中存在的过氧化氢酶分解成氧气和水。通过植物块茎与过氧化氢相遇后所发生的反应可间接证实该酶的存在。

【 器材与试剂 】

1、器材：光学显微镜、剪刀、镊子、刀片、染色缸、牙签、载玻片、盖玻片。

2、材料：大白鼠（或豚鼠）、马铃薯。

3、试剂：3%过氧化氢溶液、0.5%硫酸铜溶液、1%番红水溶液、联苯胺混合液（临时配制）。

4、试剂的配制：

（1）3%的过氧化氢溶液：量取H2O21.5ml加入到48.5ml蒸馏水中。

（2）0.5%硫酸铜溶液：称取硫酸铜0.5g溶于100ml蒸馏水中，再加3%的过氧化氢溶液2滴。

（3）1%番红水溶液：称取番红O（Safranine O）染料粉1.0g溶于100ml蒸馏水中。

【 内容与方法 】

一、大白鼠（或豚鼠）骨髓细胞过氧化物酶的显示

1、将大白鼠置于装有乙醚棉球的标本缸中，使其麻醉后断颈处死，剪开其大腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，用剪刀剪断或折断，再用牙签挑取骨髓制备骨髓涂片，晾干。

注意：涂片时要薄而均匀，否则无法观察结果。

2、将涂片放入盛有0.5%硫酸铜的染色缸中固定30秒钟。

3、取出涂片直接转入盛有联苯胺混合液的染色缸中处理3分钟。

4、清水冲洗。

5、放入1%番红溶液中处理1分钟。

6、清水冲洗，室温下晾干。

7、观察。光镜下可见骨髓细胞中存在一些被染成蓝色或棕色的颗粒，便是过氧化氢酶存在的部位。

注：该项实验也可用小鼠的血液为材料，观察血液中巨噬细胞所呈现出的蓝棕色颗粒。

二、植物细胞中过氧化氢酶的间接显示

取马铃薯块茎一个，用徒手切片法切取一小薄片放于载玻片上，滴加3%的过氧化氢溶液，稍等片刻，可见组织四周出现大量的气泡，提示植物细胞中有过氧化氢酶的存在，用煮熟的马铃薯重复上述过程，结果应该如何？

【 作业与思考 】

1、绘图表示细胞内过氧化物酶的分布。

2、细胞中的过氧化物酶有何生理功能？

实验四    酸性磷酸酶的显示方法 

一、实验目的

1. 掌握Comori 法的基本原理和方法。

2. 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。

二、实验原理

酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基，在PH5.0 的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性璃酸酶在细胞内的存在与分布。

本实验的技术特点是：①用冷冻涂片和中性固定，可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。②采用较短的作用时间，可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象，保证了实验的可靠性。③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象，细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰，有助于深入理解细胞吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质。

三、实验用品

（一）材料小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)

（二）器材高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片及温箱。

（三）试剂

1. 10%中性(pH6.8～7.2)

甲醛                               10ml

醋酸钠                             2g

蒸馏水                             90ml

2. 酸性磷酸酶作用液

蒸馏水                             90ml

0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)         12ml

5%铅                           2ml

3.2%β-甘油磷酸钠                  4ml

先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另—份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若PH＜5.0，可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。

3. 1%硫胺溶液

硫化胺                                 1ml

蒸溜水                                 9ml

4. 姬姆萨染液(1:30)

姬姆萨原液                             3 滴

磷酸盐缓冲液(PH6.8)                    5ml

5. 3%淀粉肉汤

牛肉膏                                 0.3g

蛋白胨                                 1.0g

氯化钠                                 0.5g

蒸馏水                                 100ml

高压灭菌9.9×104Pa(15 磅)20min，再加入可溶性淀粉6g，60～80℃水浴溶

解后，4℃冰箱保存备用。

四、实验操作

1. 取小白鼠1 只、每日腹腔注射6%淀粉肉汤1m1，连续注射3 天。

2. 第3 天注射后3～4h，脱颈处死小鼠，打开腹部皮肤，暴露腹膜，再向腹腔内注射生理盐水2ml，过3min 后在原注射部位抽取腹腔液0.1～0.2ml。

3. 将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片1～2 滴。将玻片垂直插入玻片架，迅速放到冰箱内(4℃)，让细胞自行铺展。

4. 30min 后，将玻片转入10%中性，4℃冰箱内固定30min。

5. 自来水漂洗5min，把水沥干。

6. 转入酸性磷酸酶作用液中，37℃处理30min。

7. 自来水漂洗片刻。

8. 1%硫化胺处理3～5 min。

9. 自来水冲洗，甩干。

10. 用1:30 的姬姆萨染液染色15min。

11. 自来水冲去染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜检。

12. 对照实验

将第3 步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min，使酶失活，再进行6～11

步的同样实验。

五、实验结果

在巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和班块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富，整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。

六、实验报告及作业

1. 简述酸性磷酸酶显色的原理是什么？

2. 绘制一张实验所见的巨噬细胞中酸性磷酸酶显色图。

实验五    细胞骨架系统的显示与观察

一、实验目的

1、掌握考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）染细胞胞质微丝的方法。 

2、 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。 

二、实验原理

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。 

染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。 

三、实验用品

材料 洋葱鳞茎内表皮细胞或培养的成纤维细胞。 

试剂 ： 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法、 M-缓冲液 、1%的Triton X-l00/M-缓冲液、0.2%考马斯亮蓝R250染液、 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2  

器材 普通光学显微镜、恒温箱、培养皿、烧杯、吸管、载玻片及盖玻片、镊子。

四、实验操作

         撕取一薄片洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm3）于载玻片上或取长有成纤维细胞的盖片条

                       ↓ 

               PBS液轻轻涮洗 

                      ↓ 

         l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min（室温或37℃） 

   （Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰） 

                       ↓ 

          M-缓冲液轻轻洗细胞3次（稳定细胞骨架） 

                   ↓ 

         3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min 

                    ↓ 

              PBS液洗细胞若干次 

                 ↓滤纸吸干 

            0.2%考马斯亮蓝R250染片30min 

                 ↓ 

            小心地用水漂洗 

                  ↓ 

               空气干燥 

                 ↓ 

           直接观察或用树脂封片