实验三、淀粉酶活性的测定实验报告

一、实验目的：

1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义；

2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。

二、实验原理：

    淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，70℃ 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。

    淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力（单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量）。三、实验用具：

1、实验设备

研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。

2、实验材料与试剂

  （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。

  （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液；

  （3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入；

  （4）麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中；

  （5）pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。

  （6）0.4mol/L的NaOH溶液；    

  （7）1%NaCl溶液。 

  （8）实验材料：萌发的谷物种子（芽长约1cm）

四、操作步骤

1、酶液提取：取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。

2、a- 淀粉酶活力测定 

(1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。

(2) 于每管中各加酶液lml ,在 70℃士0.5℃ 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。

(3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 

(4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。

(5) 将4支试管置另一个40℃士 0.5℃ 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。

3、淀粉酶总活力测定:取酶液5ml,用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号,2支为对照,2支为测定管，然后加入稀释之酶液lml，在对照管中加入4m1 0.4mol 氢氧化钠，4支试管中各加1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（ 5 ）步的操作,同样准备测糖。

4、麦芽糖的测定 

    (1)标准曲线的制作: 取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液（ lmg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热10min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量（ mg ）为横坐标,绘制标准曲线。

    (2) 样品的测定: 取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂.以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。

五、结果处理 

        式中 A 为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（ mg ）； 

    Ao 为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（ mg ）； 

     B 为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（ mg ）； 

    Bo 为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（ mg ）； 

           V T 为样品稀释总体积（ ml ）； 

   V U 为比色时所用样品液体积（ ml ）； 

     W 为样品重（ g ）.

    本实验规定：40℃时5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。