有机酸柱使用手册

Chrompack Organic Acids Column

注意

Chrompack Organic Acids 色谱柱填充的是聚合物材料，需要特殊的维护。向柱内导入以下介绍了的以外的有机溶剂会导致聚合物材料膨胀和过度增压。因此，你应当在安装柱子以前，先用异丙醇，然后用0.1N的硫酸十分彻底地冲洗管路以彻底去除有机溶剂。

在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。未正确地使用不能享受保修待遇。

1． 简介

Chrompack Organic Acids柱填充有氢形式的阳离子排斥树脂，特别开发用于在低牙条件下分离包括酒、果汁、奶制品、生物样品、工业原料和环境样品中的有机酸。

2． 洗脱

推荐使用浓度范围在0.002到0.05N的稀硫酸溶液。

大多数的分析使用0.01N的硫酸（pH=±2.3）都可以获得成功。其他的强酸例如磷酸和高氯酸也可以使用，但是卤酸例如盐酸不推荐使用，因为它们会腐蚀不锈钢。

当有强酸用于柱子的洗脱液的时候，柱子就进行了自身再生。所以，特别的再生步骤是不需要的。但是这样并不能直接对洗提强度和大多数有机酸的保留性质进行校正，较强的洗提强度通常只减少最后馏出的化合物的保留时间。

在使用以前，所有的洗脱液都要用0.45μm滤膜过滤和脱气。

对于这个柱子，使用有机相修正，例如乙腈（最大20%），可以缩短保留时间。这样做，总是会造成背压的升高。所以，较高的操作温度和较低的洗提流速通常可用于防止产生过高压力。

注意，一旦对柱子使用了有机相修正，柱子就会保留使用了有机相修正的洗脱液的色谱特性，即使洗脱液已经恢复到原始的100%的水相，柱子的性质也不会回到当初发货时的状态了。

因此，如果你的应用中包括有芳香酸或不饱和酸，它们会出现较长的保留时间，我们推荐使用Chrompack的芳香酸柱（Cat.no.28352），它是专门设计用于此类化合物的。

3． 流量和压力

推荐用于Chrompack Organic Acids柱的流量是0.3-0.8ml/min。任何情况下洗脱流量都不能超过0.8 ml/min，记住柱子压力产生的原因有洗脱流速，柱温，洗脱液的黏度等等。

要洗提流速，使泵压力不超过2200PSI。在45°C，0.6ml/min流速时，预期的压力应当在600-1500 PSI之间。如果在此条件下，柱压超过了1200 PSI，通常指示有污染物沉积在填充材料上，必须采取改正的措施。（见有关柱效丧失的原因一节）。

4． 样品准备

保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将脂肪，油脂，蛋白质物质和重金属离子导入色谱柱， 不管是流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。

生物样品在注射以前必须除去蛋白质。较好的除蛋白试剂是磺基水杨酸。

5． 柱前过滤器

柱前过滤器含有0.5-2.0um的多孔不锈钢烧结物，安装在样品注射器和柱子之间用于从洗脱液中去除颗粒物。这样可以防止分析柱产生压力增高的问题，延长柱子的寿命。当有保护柱的时候，柱前过滤器就可以不用了。

6． 保护柱

保护柱应当用在这个柱上，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高。样品中诸如盐和蛋白质类的污染物可能会使柱效降低，在注射进柱子以前应当去除。

7． 样品量

通常使用的样品量在10-50微升的范围内，但是进样高达100微升应当没有问题。进样500微升或者更多可能会导致峰变宽或者融合。

8． 温度

Chrompack Organic Acids柱可以在20-90°C使用。提高柱温会改善柱效。然而，柱温也会样品的保留，所以建议使用柱温箱以保证得到可以重复的结果。

由于某些分离对温度非常敏感，所以有必要仔细地操控温度以优化分离效果。如果在室温使用这个柱子，洗脱流速必须降低保持泵压不高于2200PSI。

9． 贮存

柱子提供给你的时候使用0.01N的硫酸作为平衡。这也是建议的用于贮存的洗脱液。柱子在保存的时候，一定要使用提供的螺丝和垫圈将端口密封。

色谱柱必须以这种方式使用和保存，在任何时候都要保证不使柱床干涸。

不正确的贮存（没有密封）或不正确的使用，会导致填充材料部分地干涸，会 发生高的柱压。在这种情形下，可以倒转柱子，要以0.1ml/min 的流速在90°C向柱子泵入0.01N的硫酸。

逐渐增加流速到0.5ml/min。你将会得到正常的压力，柱子将可以用于任意方向。如果这样还不能解决问题，柱子可能有颗粒物或其他物质的污染。

10． 柱效丧失的可能原因

1． 额外的峰展宽。要保证管路的长度和内径都保持最小。

2． 不正确的柱温。

3． 不正确的洗脱流速。

4． 在开始洗脱的时候，平衡时间不够。

5． 洗脱液的pH或离子强度不正确。

6． 不正常的阳离子（如Na+或H+）。

7． 聚合物污染。

a. 高柱压伴随柱效降低。

1． 颗粒物积聚在烧结物或者聚合物床上。

（a） 样品来源---过滤或离心

（b） 洗脱液来源---过滤洗脱液，封闭洗脱液容器。

（c） 系统来源---冲洗整个系统管路和泵；安装在线系统

过滤器。

2． 蛋白质类物质的积聚

（a） 微生物在样品中生长。

（b） 微生物在洗脱液中生长。

b. 正常柱压伴随柱效降低1． 金属离子污染

（a） 不确切的钢合金存在于系统中。

（b） 洗脱液含卤素。

（c） 在制备或者运输过程中洗脱液金属离子污染。

2． 有机污染

（a） 样品中有脂肪，油脂，脂质。聚合物的表面被

覆盖。

（b） 从样品中或者未正确制备的洗脱液中带来的非

特定的有机 物。

（c） 在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定

有机物，例如在运输时从大气中带来。

8.床压缩

a. 过高的洗提流速

b. 使用了不正确的有机相修正或其浓度过高。

c.

11． 色谱柱再生

使用稀硫酸（或其他强酸），通常这种洗脱液会将被样品组分替换掉的氢离子补充回来而再生柱子。因此，不必要采取特别的再生步骤。12． 用于纠正聚合物污染或聚合物床压缩的可能的操作

1． 制备新鲜的洗脱液

在很多情况下，柱效的丧失会归结为洗脱液的污染。所以，要在使用柱子以前要制备新鲜的洗脱液，冲洗所有液体管路。洗脱液在使用以前，应当用0.2到0.4微米的滤膜过滤。

2． 聚合物床的“放松”

如果使用了不正确的高流速的话，很多聚合物与硅胶连接会缺乏硬度而可以被压缩或坍塌。然而，它们是可以回弹的，在很多情况下，压缩是可以恢复的。

要修复坍塌的聚合物床，关闭泵，使聚合物放松30分钟。倒转色谱柱，泵入洗脱液，0.1毫升流速，65°C淋洗过夜。

恢复色谱柱的正常条件。

3． 倒转色谱柱

如果柱效问题依旧存在，可以将柱子倒转，用标准的操作条件在这个反方向操作。如果柱效恢复正常，继续在这样的状态工作。如果没有改善，聚合物也许就永久地污染了而需要更换。如下所述，清洗和再生步骤的关键在某种意义下是从聚合物床上清洗污染物，从而恢复柱效。然而，重要的是在再次使用柱子之前要尝试查找问题的根源。

4． 色谱柱清洗

准备25%乙腈的水溶液。设定柱温为65°C，使洗脱液反方向0.1毫升流过色谱柱。然而，不要使柱压超过2200psi，如果必要，调整柱流速，向柱内泵入此溶液4小时（如果污染特别严重，就要过

夜）。在正常条件下测试柱子。如果压力恢复到正常，但是分辨率依然很差，就要尝试如下所述的柱再生步骤。如果压力没有恢复正常，柱子也许就永久地损坏了而需要更换。

5． 色谱柱再生

准备含0.05N的硫酸溶液。设定柱温为65°C。使柱子反方向，以正常洗提流速泵入此酸溶液。注意观察柱压，不要是柱压超过

2200psi，如果必要，调整柱流速。向柱内泵入此溶液2小时（如果污染特别严重，就要过夜）。

6． 色谱柱的检查

将柱温恢复到正常。以正常的流速在正常分析条件下操作，但是要反方向。如果柱效没有恢复，将柱子正方向安装，重复以上步骤。注意可能需要一些时间来使基线稳定。

7．色谱柱的更换

以上步骤只在某些情况下可以恢复柱效。对于这些处理手段，重金属和某些有机物污染可能无效。在这种情况下，必须更换柱子。明智的做法是在安装新柱子以前，找到问题产生的原因。仔细阅读Chrompack的文件。记住保护柱的使用会延长柱子的寿命以及防止很多污染问题。

以上内容由美国瓦里安技术中国有限公司北京办事处李华译自Chrompack Organic Acids柱随柱附带操作手册。

2002年5月15日