人类基因组DNA的提取与鉴定

实验目的

1、学习人类基因组DNA的提取原理和方法。

2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。

实验原理

哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

一、材料

一份提取总DNA的细胞或组织

    1.5ml Eppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）。

二、设备 

离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。

三、试剂 

1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA

2．0.8%（W/V）标准琼脂糖；

3．0.5×TBE缓冲液

4．其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）

四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）

（一）DNA的提取

1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清；重复1次。

2. 沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350l STE和150l 10% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10l 20mg/ml蛋白酶K，摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3~4小时。

3．加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。

4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。

5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100l TE中，测OD值。

7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

（二）DNA的鉴定及定量

1. 比色法: DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

    DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或TE把提取的样品稀释100倍。将紫外分光光度计的波长设为260nm，以重蒸水或TE做为对照，测定OD值。

        OD260=              ；

        DNA的浓度=50 OD260 稀释倍数=           。

将波长换成280nm及230nm，用同一样品再次测定OD值：

        OD280=             ；OD230=             ；

OD260/OD280 =        ；OD260/OD230=        ；

       结论：所提取的DNA                                        。

2.  电泳鉴定

取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA相同或稍慢，证明分子量均 >50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行性内切酶图谱分析。

五、 注意事项

1.酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。

2.保温可在45~55℃范围内进行。

3.真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管， 以防机械力（震动）将DNA分子打得太碎。

4.沉淀DNA时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。

5.DNA溶于TE溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些TE溶液。这样能保证DNA样品不至于太稀而无法使用，一般来讲，DNA浓度为0.4~0.6mg/ml最为理想。

6.溶于TE溶液中的DNA样品比较稳定，可在4℃冰箱中存放1年而不会降解。

思考题：

1、我们知道，一条染色体含有一条DNA，基因组中不同的染色体DNA的大小是不同的。按理来说，所提取的基因组DNA中含有多条大小不一的DNA。但为什么用琼脂糖电泳后仅能见到一条主带呢？

2、基因组DNA制备过程中提取缓冲液有哪些成分，作用是什么？

3、基因组DNA制备过程中需注意的事项有哪些？

扩展内容

植物基因组DNA的提取

利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS裂解细胞，使蛋白质变性沉淀，用酚氯仿抽提除去蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

一、材料

    鲜嫩的水稻幼苗或其它禾木科植物。

液氮，陶瓷研钵，50ml离心管或1.5ml离心管，头，药勺。

二、设备 

    冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，移液器，电泳设备等。

三、试剂 

 1．提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0；5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS，1mol/Lβ-巯基乙醇。 

2．RNase A母液。 

3．5mol/L KAc

4．其它试剂：酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，氯仿，异丙醇，TE缓冲液，70%乙醇，灭菌双蒸水ddH2O。 

四、操作步骤：

（一）植物组织裂解液抽提

1. 取3-5克嫩叶, 剪碎, 研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入50ml（1.5ml）离心管中，加入20ml (1ml) 提取缓冲液, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟 (时间长，DNA产量高), 不时摇动。

2. 加入5ml (150ul)5mol/L KAc, 颠倒混匀冰浴静置20分钟。

3.室温下5000rpm离心20分钟。 

（二）植物基因组DNA纯化

1. 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(在通风情况下操作)。待分层后，12000rpm离心 5分钟。

2. 取上清液至干净离心管, 加等体积氯仿抽提(在通风情况下操作)，12000rpm离心 5分钟。 

3. 仔细移取上清液至另一50ml（1.5ml）离心管，加入1倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 

4. 12000rpm离心 5分钟，获得沉淀后，用70％酒精洗涤2-3次，风干沉淀。

（三）植物基因组DNA的溶解、检测和保存

1. 在1.5ml eppendorf中加入1ml (100ul) TE。DNA很快溶解于TE。 

2. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA (RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 

3. 取2μl DNA样品在0.8% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

五、注意事项

1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。

2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。

附录1 DNA提取史中的重要事件

Fricdrich Miescher(1844-14),瑞士生理学家，有机化学家。1868年医学院毕业后，在著名的有机化学家 Hoppe-Seyle的实验室以浓细胞为材料，研究淋巴细胞的组成。1869年，他从浓细胞的细胞核中分离出含有大量磷的“核素”，核素即是DNA。这是人类第一次提取的DNA。

Marmur于1961年建立了用酚和氯仿从生物细胞中分离制备DNA的经典方法。但是此法的条件比较剧烈，还只能得到分子量为5×106-5×107道尔顿的DNA制品，从六十年代后半期开始，尤其是蛋白酶K的发现，大大促进了真核生物细胞中分离提取高分子量DNA的研究。在SDS和EDTA的存在下，蛋白酶K仍具有很高的活力，因而可在抑制DNA降解酶活力的条件下用蛋白酶K消化去除蛋白质，为制备高纯度、高分子量的DNA制品创造条件。

附录2  试剂准备

1．STE裂解液：2.5M NaCl 4ml，2M Tris-HCl (pH 8.0) 0.5ml，500mM EDTA (pH 8.0) 0.2ml，加水定容至100ml。

2．酶解液：200mM NaCl，20mM Tris-HCl (pH 7.4)；50mM EDTA (pH 8.0)，1.5％SDS。

3．蛋白酶K：10mg/ml 配好后用一次性滤膜过滤，-20℃保存。

4．氯仿：异戊醇=24∶1 

5．Tris饱和酚（pH 8.0）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

6．无水乙醇、75%乙醇, 灭菌双蒸水ddH2O

7．RNA酶A母液：将RNA酶 溶于TE配制：10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活，贮存于-20℃。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。

8. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

9. TAE电泳缓冲液，50X储存液，pH8.5：242gTris碱，57.1ml冰醋酸，37.2 g Na2EDTA.2H2O，加水至1L；1X工作液： 40mmol/L Tri Ac，2mmol/L EDTA

10．溴化乙锭（EB）：10mg/ml

11. 上样缓冲液（6×loading buffer）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

12.  DNA Maker标准分子量。（Lambda DNA/EcoR I+ Hind III  Makers）

13.  0.8% 琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

14. 溴化乙锭(EB)溶液母液: 将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。（ 注意：EB为强诱变剂，操作时带手套，轻轻摇匀。）