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收稿日期：2009-10-19

生物活性肽是一类分子量较低的小分子蛋白,具有特殊的生物活性。以水产动物为原料通过酶解制备的生物活性肽具有抗氧化、

降血压、免疫等多种生物学活性[1-2]。文蛤又名花蛤，属软体动物门、双壳纲、真瓣鳃目、帘蛤科、文蛤属。其贝壳略呈三角形，腹缘呈圆

形，壳质坚厚，两壳大小相等，喜生活在有淡水注入的内湾及河口附近的细沙质海滩。文蛤肉嫩味鲜、营养丰富，含有蛋白质10%，脂肪1.2%，碳水化合物2.5%，还含有人体易吸收的各种氨基酸等功能成分。本研究采用胰蛋白酶在其适宜条件下水解文蛤，采用离体试验系统（Fenton 体系）检测酶解物对羟自由基（·OH ）的清除作用，进而利用Sephadex G-15凝胶层析法分离

酶解文蛤小分子肽分离纯化及生化特性

邱春江1，姚兴存1，赵培培1，薛长湖2

（1.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港222005；2.中国海洋大学食品科学系，山东青

岛266003）

摘要：通过对文蛤胰蛋白酶解物中的小分子肽进行Sephadex G-15凝胶层析，利用Fenton 体系测定洗脱液对产生的

·OH 的清除效果，找出具有活性的抗氧化肽后利用Tricine －SDS －PAGE 方法鉴定洗脱液的分离纯度。结果显示：文蛤在酶解温度50℃、pH=8.0~8.5，加酶量为2%，当酶解时间为8h 时所得酶解物对羟自由基清除率不高；仅将酶解时间减半，重复以上操作，所得酶解物对·OH 清除率明显提高，达到94.02%，将其经Sephadex G-15凝胶层析后，发现由第3个峰所收集到的洗脱液的清除率最高，电泳结果显示本峰纯度较高。关键词：文蛤；酶解物；活性肽；羟自由基；电泳

Separation and Purification the Minor Peptides from the Meretrix Linnaeu Protein Hydrolysates and the

Investigation of the Biochemical Properties

QIU Chun-jiang 1,YAO Xing-cun 1,ZHAO Pei-pei 1,XUE Chang-hu 2

（1．Huaihai Institute of Technology Key Constructing Lab of Marine Biotechnology of Jiangsu Province ，L i anyungang 222005，

Jian g su ,China ；2．College of Fisheries ，Ocean University of China ，Qingdao 266003，Shandong ,China ）Abstract :The purpose of this study was to explore the meretrix linnaeu protein hydrolysates with Sephadex G-15,and the scavenging activity （SA ）of them on hydroxyl free radical produced by Fenton reaction,find out the antioxidant activity of the peptides .Then investigate the Separation of purity with the Tricine －SDS －PAGE.The result show that the SA of the enzymatic hydrolysates is not very good at time duration 8h,temperature 50℃,pH 8.0-8.5,enzyme content 2%

（w /w ）.Then halved the hydrolysis time and made other conditions remain unchanged,its SA is 94.02%.It shows that the third band has the highest SA and also has the high purity by electrophoresis after the meretrix linnaeu enzymatic hydrolysates with Sephadex G-15.

Key words :Linnaeu ;enzymatic hydrolysates;bioactive peptides;hydroxyl free radical;electrophoresis

作者简介：邱春江（1971—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：水产品加工与贮藏。

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基础研究

4

20

10年

5月第31卷第5期

食品研究与开发

文蛤酶解物中的抗氧化活性肽，并借助Tris-Tricine-SDS-PAGE 方法鉴定分离纯度，旨在为文蛤有效活性成分的提取及其生化特性的探索提供参考。1材料与方法1.1材料

1.1.1

原料及预处理

鲜活文蛤：购买于连云港市农贸市场。

预处理：清洗→除杂→去壳→组织破碎→贮于冰箱备用。1.1.2

主要试剂与设备

胰蛋白酶、2-脱氧核糖、Sephadex G-15、丙烯酰胺、

N,N,-甲叉双丙烯酰胺、Tricine 等。Biologic DuoFlow 蛋白质层析系统：美国伯乐公司;Synergy 全自动酶标检测仪：美国BioTek 公司;DYY-12C 型电泳仪：北京市六一仪器厂;CR22G 型日立高速冷冻离心机：日本HITACHI 公司;UV-754型紫外可见分光光度计：山东高密彩虹分析仪器有限公司;FW-100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司等。1.2方法

1.2.1

胰蛋白酶解液的制备

参照相关文献，确定酶解条件：料水比1∶3（g/mL ），温度50℃、pH 8.0~8.5、加酶量2%、初定时间8h [3-4]。1.2.2

酶活力的测定

根据Folin 酚法[5]进行测定：胰蛋白酶活力为7.4×103U/g 。1.2.3

羟自由基清除率的测定

采用酶解物对Fenton 体系产生的羟自由基清除率的体外试验进行测定[6-7]。

文蛤匀浆液自身对羟自由基具有一定的清除能力，测定SA 值为78.75%，这可能与其水溶性蛋白及自溶作用而产生的肽、氨基酸等有关。

在上述酶解条件下，采用胰蛋白酶酶解文蛤所得的酶解液对羟自由基清除率为84.90%，考虑到酶解时间与小分子功能肽的关系，适当降低酶解时间，使其减半，其他条件不变，重复上述操作，测定胰蛋白酶解液对羟自由基的清除率为94.02%。1.2.4酶解物中小分子肽的分离

酶解物中小分子肽的粗分离采用G-15凝胶层析法[8]，取2mL 胰蛋白酶解液进行Sephadex G-15凝胶柱层析分离，流速为0.4mL/min ，每管收集2mL ，由此得到洗脱吸收峰。1.2.5

小分子肽的分离纯度鉴定

采用Tricine-SDS-PAGE 电泳方法检测小肽的分

离纯度[9-10]。2结果与讨论

2.1

胰蛋白酶解液中小分子肽的分离纯化

取所得胰蛋白酶解液（酶解时间8h ）2mL 进行

Sephadex G-15凝胶柱层析分离，流速为0.4mL/min ，每管收集2mL 。由此得到洗脱吸收峰，

洗脱情况如图1所示；然后进行羟自由基清除率测定，其结果如图2所示。

再取仅将酶解时间缩半所得的胰蛋白酶解液2mL 进行上述操作，其结果分别如图3及图4所示。

基础研究

5

20

10

年5月第31卷第5期食品研究与开发

2.2

小分子肽的分离纯度鉴定

利用Tricine-SDS-PAGE 聚丙烯凝胶电泳鉴定小肽的分离纯度。

胰蛋白酶解液（酶解时间8h ）经层析分离纯化的小分子肽样品采用电泳法检测所得图谱如图5所示。其中第1、2个泳道是收集的第1个峰的样品；第3、4个泳道分别是收集的第2个峰的样品；第5、6个泳道是收集的第3个峰的样品；

第7、8个泳道是收集的第4个峰的样品；第9、10个泳道是收集的第5个峰的样品。

由图5可知，第7、8个泳道中间出现1个条带，说明分离纯度较好，测定由本吸脱峰收集到的小肽对羟自由基的清除率为25%。

胰蛋白酶解液（酶解时间4h ）经层析分离纯化的小分子肽样品采用电泳法检测所得图谱如图6所示。

由图6可知：第5、6泳道中间出现1个条带，说明分离纯度较高。测定由本吸脱峰收集到的小肽对羟

自由基的清除率为67%。3结论

文蛤在酶解温度50℃、pH 8.0~8.5、加酶量2%、酶解时间8h 时所得的胰蛋白酶酶解产物对羟自由基清除率（SA ）为84.90%，由于文蛤匀浆液自身对羟自由基具有一定的清除能力（SA ：78.75%），由此可见其

清除效果不甚理想；考虑到酶解时间与小分子功能肽的关系，适当降低酶解时间，使其减半，其他条件不变，重复上述操作，所得酶解物对·OH 清除率明显提高达到94.02%，

将其经Sephadex G-15凝胶层析后，发现由第3个峰所收集到的洗脱液的SA 值最大为67%，电泳结果显示本峰纯度也高。

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收稿日期：2009-09-01

基础研究

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