DNA序列分析

JOURNAL OF NANJING UNIVERSITY OF CHE MIC AL TECHNOLOGY

　　　　　　Vol.23No.1

Jan.2001

DNA序列分析

郜　虹　姚　成

(南京化工大学理学院,南京,210009)

欧阳平凯

(南京化工大学制药与生命科学学院,南京,210009)

摘　要:综述了DNA测序技术。对DNA序列分析方法,包括:毛细管电泳、阵列毛细管电泳、芯片毛细管电泳、超薄层毛细管电泳、质谱法、原子探针法、杂交法、流动式单分子荧光检测法,作了详细评述。

关键词:DNA　电泳　序列分析

中图分类号:O657　　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1007-7537(2001)01-0079-08

　　DNA序列分析在基因工程和分子生物学研究中一直是一项重要的手段,也是该领域最重要的技术之一,是了解基因结构和功能的基础途径。九十年代“人类基因组计划”(human genome project)的启动,有力地推动了高速DNA测序技术的发展[1]。近年来DNA序列分析除了经典的测序方法在技术环节上有许多新的改进外,还发展了一些全新的DNA 测序方法。目前国际上正在研究的DNA序列分析技术有两类:第一类被称为“Evolutionary improve-ment”,即进一步发展与完善目前广泛采用的以凝胶电泳分离为基础的DNA序列分析技术,如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层板凝胶板电泳法;第二类被称为“Revolutionar y methods”,即抛弃凝胶电泳分离步骤的直接测序方法,如质谱法、杂交法、原子探针显微镜法、流动式单分子荧光检测法等。

经典的DNA测序方法就其原理来说主要分为化学测序法和双脱氧链终止法(酶法测序)。

1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法,即将模板DNA的一端标记之后,在4组或5组互为的化学反应中分别得到部分降解,其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中通过化学裂解形成具有共同起点而终点不同的放射性标记的分子。经过电泳及放射后自显影可以读出距离标记位点250个核苷酸以内的DNA序列,不仅适于单链,也可用于双链测序。到目前为止,这一技术在模板DNA标记和特异性化学反应方面都进行了改进,DNA序列的可读性也随之提高,成为DNA序列分析的基础方法之一。1995年有报道使用一种“链亲和素包裹磁性颗粒”的固相化学测序方法[2],采用化学发光物1,2 -dioxetane为底物完全代替同位素进行标记。这种方法是基于生物素-DNA-链亲和素混合物的发现。此种混合物在化学测序反应条件下保持稳定。用凝胶电泳分离,转到尼龙膜上,然后对化学发光物检测可显示序列结果。也有利用膜上的DNA通过生物素-亲合素-生物素间接挂上碱性磷酸酶进行化学反应,然后检测序列。由于完全排除了化学物质的污染,又压缩了传统的化学测序方法的沉淀/离心作用的实验时间,结果可获得高质量的序列梯度。九十年代后期曾宪春等[3]将Sephadex G-50凝胶离心柱方法用于纯化测序模板质粒DNA,大大简便了测序工作。

70年代Sanger推出了双脱氧链终止法。用链终止剂2′,3′-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)取代一种脱氧核苷三磷酸(dNTP),其中dATP可用放射性同位素标记.在含有模板引物的A、G、C、T4个反应管中,DNA聚合酶合成出一系列以ddNTP为3′末端的

收稿日期:2000-06-15

作者简介:郜　虹(1976年生),女,南京人,硕士,从事应用化学现代分析等方面研究。

不同长度的新链,经过电泳和放射、显影后能迅速地读出DNA序列。1981年Messing等研究出以噬菌体M13为克隆运载体的改进链终止法,接着1982年Hong提出了系统测序法,这一系列重要进展把DNA 测序效率推向空前的水平。在酶法测序中DNA聚合酶和DNA片段的标记是两大关键步骤。80年代末90年代初新型聚合酶的引进以及噬菌体T7基因6外切酶应用于制备单链测序模板,使双链质粒载体的测序提高到新的水平。传统上酶法DNA测序都依赖于放射性标记技术,由于放射性同位素操作带来众所周知的麻烦,利用地高辛和生物素测序是早期发展的一种测序手段[4,5]。美国加利福尼亚技术研究所(California Institute of Technology)与应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.)[8]合作研究发展了完全不用同位素而借助荧光标记、激光和计算机技术,能以极快的速度进行DNA序列的自动分析测定的DNA测序技术。又如Promega[3]公司推出的银染测序方法,利用较为敏感的银染色来检测序列胶中的DNA条带。这一方法比传统的检测手段快速、安全、费用低廉,成为双脱氧法序列分析中独具魅力的测序系统。另外热循环测序也是酶法测序的一种改进[5]。当模板DNA分子过少时,可用耐热DNA聚合酶按PCR方法通过变性、退火、合成等步骤进行模板的扩增。最近有报道关于采用末端标记引物法进行双链DNA循环测序获得非常好的效果[6]。

1　电泳分离测序技术

1.1　板凝胶电泳法

目前在DNA的测序和有关方面的研究工作中,用得最多的是电泳方法。70年代,电泳技术利用抗对流介质,如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶,进行50千碱基对(50kbp)碎片的日常分析,但对分离更大的碎片(高至750kbp)的应用情况就不大适用。为了适应大规模测序的需要,高速DNA测序技术不断发展,人类基因组大规模DNA测序,已普遍采用板凝胶电泳及激光荧光实时检测法。基于双脱氧链终止法的原理,采用激光诱导荧光进行检测。

80年代末至90年代美国PE公司陆续推出了自动DNA序列测定仪370A、373A和377型。该仪器系统采用了4种不同的荧光染料标记引物,进行碱基的DNA合成,经电泳分离后,用激光激发获取DNA片段信息[7]。早期的板凝胶电泳系统如ABI373采用较厚凝胶板(400μm),由于电泳产生的焦耳热不易扩散,所以只能采用较低的电场强度(30 V/cm),须8～12h才能完成电泳分离及检测。由于超薄凝胶板电泳的发展,以及对DNA分离热力学研究的推进,新型自动化DNA测序仪如ABI377型采用薄凝胶板(100～200μm),电场强度提高到100～150V/cm,电泳分离由室温提高到60℃,在2.5～3 h内完成测序,每条泳道可测序450～500b[9]。90年代初欧洲分子生物学实验室(E MBL)与瑞典Phar-macia-LKB公司也联手推出了最新型适用于定向测序的全自动激光序列分析仪(Automated Laser Flu-orescent Sequencer,A.L.F),完成了DNA序列测定的又一次重大突破[2]。

1.2　毛细管电泳法

过去板凝胶电泳一直是DNA序列分析唯一的标准方法,但其分析速度远不能满足人和水稻基因组项目中大量DNA序列分析的要求。

核酸是多种核苷酸聚合的大分子聚合物,DNA 切成片段,发生测序反应后,通过毛细管筛分介质,按照分子大小进行分离,经过检测器收集序列信息,达到测序的目的。其中分离过程是关键,不同的筛分介质,由于其筛分机理各异,从而对DNA片段的分离效果有差异。

1.2.1　毛细管凝胶电泳

毛细管具有高表面/体积比,有优异的传热性能,因此毛细管电泳允许使用比板凝胶电泳更高的电场强度。在毛细管凝胶电泳DNA序列分析中一般采用内径50～75μm毛细管,使用电场强度比平板凝胶电泳提高近一个数量级,实现高速及高分辨分离碱基。

进行DNA序列分析关键是速度、灵敏度、分辨率、凝胶筛基质(sieving matrices)和分离机理几方面。毛细管凝胶电泳的电泳速度比板凝胶电泳速度快25倍,但由于凝胶的化学不稳定性,凝胶柱一般不重复使用,在测序过程中须花费大量时间制备凝胶柱。

DNA测序中凝胶毛细管电泳柱主要以聚丙烯酰胺凝胶作筛分介质,虽然理论上凝胶是理想的介质,它黏度大、抗对流,能减少溶质的扩散,柱效极高,有极好的分离效果,但制作合用的凝胶毛细管电泳柱十分困难,在制作过程中有难以除去的空泡生成,影响分离,而且寿命偏短。Baba等提出一种方

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1.2.2　非凝胶基质毛细管电泳

由于毛细管凝胶电泳制备凝胶柱费力,非凝胶基质的研究引起人们广泛的兴趣。近年来应用非凝胶基质毛细管电泳分离DNA性片段有不少报道。其中线性聚丙烯酰胺非凝胶基质,纤维素衍生物非凝胶基质用于电泳分离DNA性片段的报道较多,在优化条件下,可以获得高效及高速分离。另外羟基乙基纤维非凝胶基质,羟基丙基甲基纤维素非凝胶基质也有研究,插入荧光剂,采用激光荧光检测,检出限可达5×10-10g/mL。

无筛分技术用低黏度线性高聚物溶液代替聚丙烯酰胺,不在柱内作交联反应,可避免空泡形成。而且柱子寿命长,制备容易。常用的无胶筛分剂有未交联的聚丙烯酰胺,甲基纤维素及其衍生物,聚乙二醇和葡聚糖等,DNA片段分离通常用前两种。目前关于这方面的研究主要集中于:筛分机理研究,高效、低黏度的聚合物分离介质的筛选及相关仪器的研究。1987年Cahen等试用质量分数9%～12%的聚丙烯酰胺分离DNA片段,19年朱明德等提出在缓冲液中加入纤维衍生物,分离了DNA片段,取得了很好的效果[12]。1991年Gr ossman和Soane将交缠溶液理论引进到聚合物溶液筛分DNA中[13],并通过实验方法得到临界交缠浓度C﹡。B orron以羟乙基纤维素(HEC)为筛分介质在临界浓度以下也得到很好的分离20～23000碱基对(bp)结果,并提出在稀溶液时筛分的瞬间偶联交缠机理[14]。Yeung等尝试用水溶性聚合物PVP、聚环氧乙烷(PE O),虽然黏度降低,但与聚丙烯酰胺比其分离效率略低[13],PVP 分离DNA性片段为最小相差4bp。Izumi等使用一种天然多糖glucomanan作为筛分添加剂,分离内切DNA片段,加入0.25%glucomanan可使分离大为改善,而且glucomanan是一种稳定、无毒、易于处理的物质,是一种很好的分离介质[10]。Grossman用羟乙基纤维素溶液作筛分介质,并用动态光散射技术研究了其性质。1992年Manz和Harrison首次研制出平板通道毛细管电泳装置,用微电子技术在平板玻璃、石英或硅片上将反应、进样、分离和检测等过程组合在2～3cm2的玻片上进行,实现在线监测的小型化、集成化、一体化、自动化,达到秒级乃至毫秒级的超高速分离。Jacobson等在通道毛细管电泳装置上设计了一个酶反应室,pBR322质粒DNA和2.8×10-3活性单位的性内切酶Hinf1加入反应室,以1%的羟乙基纤维素为筛分介质,双噻唑橙为荧光插入试剂,200s内完成DNA片段的分离,整个实验5min内完成[15]。近年Karger[16]研究组采用相对分子质量不同的混合线形聚丙烯酰胺,增强了分离效果,并使用能量转换荧光染料提高信噪比,在55min内DNA测序可达1000b。毛细管柱连续测序300次,读数长度、准确度及迁移时间均不变,是目前无胶毛细管电泳DNA测序的最佳结果,准确度达98%～99%。并且用乳液聚合法制取相对分子质量达9000000的线形聚丙烯酰胺,用于毛细管电泳高效DNA测序,奠定了长读数准确测序的基础。Yeung[17]研究组提出用线形聚乙烯氧毛细管电泳进行DNA测序,采用低电场75V/c m,测序读数也达1 000b,但须7h,如果采用程序升温2℃/min(35～65℃),分离速度可达30b/min,已用于DNA性片段快速分离。采用脉冲场毛细管电泳DNA测序,分离DNA片段可达1000b。聚乙烯氧有商品供应,不须自行合成,更易获得好的重复

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第1期　　　　　　　　　　　　　　　　　郜　虹等:DNA序列分析性。

1.2.3　阵列毛细管电泳

虽然毛细管电泳使用的电场强度比板凝胶电泳提高了近一个数量级,因而分离时间约缩短25倍,但由于每次只测一个样品,所以实际上测序效率比板凝胶电泳没有根本性的提高。

阵列毛细管凝胶电泳是将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合,采用毛细管凝胶电泳基本装置,将多支毛细管并列进行分离与检测,以板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足。

阵列毛细管凝胶电泳虽然采用毛细管凝胶电泳基本装置,但也有许多新的要求[12]:

(1)　要求高压源提供更高的输出电流,

(2)　对进样系统的自动化程度要求更高,有必要实现毛细管柱更换自动化,

(3)　要求凝胶柱的制备速度大幅度提高,

(4)　对检测系统的要求更为复杂,

(5)　要求电泳系统的同步数据处理功能大幅度提高。

1992年美国的Mathies等首先提出阵列毛细管电泳新方法,采用激光聚焦荧光扫描检测装置,25只毛细管并列电泳,每只毛细管在1.5h内可读出350bp,DNA序列分析效率可达6000bp/h,此法已用于分离及检测DNA性片段,使用可更换的羟乙基纤维非凝胶基质,溴化乙啶标记,检出限1×10-12g/每带[18,19]。1994年日本的Kambara等[20]提出另一种装置—多道套式流动池阵列毛细管DNA 分析装置。20只毛细管并列电泳,采用激光荧光电荷藕合阵列检测器(Charge Coupled Device,CCD)检测,有较高的灵敏度,但装置较为复杂繁琐。美国的Yeung等[21]又提出了100只毛细管阵列电泳装置,用光导纤维插入毛细管电泳系统,引入激光,用CCD 或CI D检测器同时检测100只毛细管的DNA样品,进行高速DNA测序均获得满意效果。另外Zhang 等[22]最近使用无交联的聚丙烯酰胺凝胶,两小时之内分离4种荧光标记的DNA片段可达0bp。

阵列毛细管电泳散热效率高,适于高电场强度电泳。使用非凝胶筛基质,毛细管壁可以抑制横向扩散,具有较易实现自动化的优点。缺点是上百支甚至上千支毛细管阵列装置,其实现商品化和用于例行分析的可行性有待进一步试验。1998年5月[23]在美国国家卫生研究院召开的人类基因组项目会议上J.C.Venter和PE公司称他们将组成一个由Venter负责的新公司将在3年内完成人类基因组全部30亿碱基测序,采用一种全部基因组鸟集合测序新技术,使用PE公司1999年推出的ABI3700型阵列毛细管电泳DNA测序仪。此型测序仪与ABI377板凝胶电泳测序仪相比,同样数量样品板电泳需8h完成,新仪器仅需15min,230台ABI3700测序仪,每个碱基仅花费0.1美元。人类基因组全部碱基测序已在2000年4月完成。

1.2.4　芯片毛细管电泳

集成毛细管电泳芯片(Integrated Capillary Elec-tr ophoresis chip,ICEC),chip是近几年出现的微量分析装置,即在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀上毛细管槽,用盖板封闭好后,利用电场分离物质,它使毛细管电泳分离物质的整个过程在一块几平方厘米的基片上得以实现。集成毛细管电泳芯片具有高效、快速、试样用量少、节约药品等优点,并开始在免疫测定、DNA分析和测序、氨基酸和蛋白质的分离、生物细胞研究等方面崭露头角。Chip将是CE发展的一个重要趋向,将一个实验室的工作集成到一块很小的芯片上,使仪器微型化,建立有一个实验室功能的芯片将是CE发展的前景。

1992年Harrison和Manz首次采用微电子刻蚀技术在玻片上研制出芯片毛细管电泳装置,分离混合荧光物质,实现了秒级甚至毫秒级的超高速分离[15]。1995年Mathies研究组首次用芯片毛细管电泳进行DNA测序研究。微通道长35mm,采用9%线形聚丙烯酰胺,电场强度200V/cm,四色荧光标记法对M13mp18DNA测序,在10min内可读碱基约为200b,准确度约97%[23]。1998年E hrlich等[24]在芯片毛细管电泳器件上,对快速DNA测序各种分离条件进行了系统研究,并与毛细管电泳测序进行比较。对单链DNA(ssDNA)采用单色DNA测序,并在熔融硅薄片上[25],用微电子技术制取115m m长通道,采用4%线形聚丙烯酰胺,在200V/c m及45℃条件下,14min可获取400b长测序数据,在400V/ cm场强下仅7min就可测序350b。芯片毛细管电泳DNA测序不仅大幅度提高了测序速度,而且还可组成超高密度阵列泳道;能有效地减少试剂消耗,降低测序费用,已列为人类基因组项目第二个5年计划重点开发测序新技术。

芯片毛细管电泳在DNA性片段、PCR产物、基因遗传诊断及短串联重复(STR)DNA等方面也有巨大的潜力。STRDNA样品在26mm长微通道

82　　　　　　　　　　　　　　南　京　化　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第23卷器件中电泳,2min内获基线分离,较板凝胶电泳分离速度快100倍,比毛细管电泳快10倍。1998年有报道以硅芯片反应器为基础的电池供电手提式微型核酸分析仪[26],可适时热循环放大及检测DNA的PCR产物。

芯片毛细管电泳是集成化技术和CE技术结合的产物。微加工是玻璃和硅芯片制作的常用技术,但其费用昂贵、技术要求高了其应用。硅橡胶芯片和塑料芯片制作较便宜、方便,但硅橡胶芯片和塑料芯片有吸附现象,印出的塑料芯片上的毛细管槽有变形现象,且同种芯片间的重复性也不太好[27]。ICEC绝大多数采用电动进样[28],检测器多为LIF,由于LIF检测器造价昂贵,采用电化学检测器是ICEC的一个发展方向。现在已有数家仪器公司致力于开发芯片毛细管电泳仪器,准备2002年前推向市场。

毛细管电泳与板凝胶电泳相比,取得3个实用的进展:(1)毛细管电泳使用可更换的无交链线形高分子分离基质,而板凝胶电泳分离操作冗长费时,且须熟练工作人员才能控制凝胶中无气泡。毛细管电泳可采用低黏度无交链高分子介质,泵入毛细管,使用后泵出,并用新鲜高分子介质更换,不用拆卸仪器。(2)弯曲的毛细管易与微量器皿相连接,可简便进样及充液。在板凝胶电泳中,须手工将样品转移入进样孔,将微量注入器插入薄层凝胶孔中,要求特别灵巧的手工操作。(3)采用密集的阵列毛细管,可开发出很大规模DNA测序仪,如Dovichi研究组开发的576支阵列毛细管电泳DNA测序系统。

检测器方面,CE对检测器灵敏度要求相当高。毛细管电泳分离单链DNA片段,用紫外吸收检测,灵敏度较激光荧光法低,但由于其价廉,在很多情况仍采用,双链DNA性片段电泳分离,应用紫外检测法则更为普遍。近几年来,国外各研究机构不断探索开发新的检测系统以提高DNA片段的检测效率,如采用半导体近红外激光器[29]、半导体激光时间分辨荧光检测器[30]、双光子激发荧光检测器[31]等。1996年PE公司推出了ABI310型毛细管电泳遗传分析仪,由单支毛细管、4种荧光染料标记引物、氩离子激光诱导荧光CCD检测,在2.5h内可测序600b。国内近年来毛细管电泳激光荧光DNA 测序中,采用分光系统及CCD摄像,提高光谱分辨率及检测灵敏度,是较先进的系统。程介克研究组[23]自行设计组装的毛细管电泳激光诱导荧光CCD检测装置可进行DNA测序、基因复制、基因突变、DNA指纹及DNA临床诊断等领域。激光诱导荧光(LIF)因趋于单分子检测限,在DNA片段分离具有特别的优势,但昂贵的造价影响了它的推广。1999年中科院党福全等[32]利用激光喇曼装置(LRS)进行CE-LI F获成功。改装组建了CE-LI F-LR 三联检测系统,以简单的结构、较低的成本,CE-LIF 达到50个分子的检测限,与国外C CD和sheath flow cuvete的系统相当。

1.3　超薄层板电泳

超薄层板凝胶电泳也是结合了毛细管凝胶电泳与板凝胶电泳的优势[19,33]:利用板凝胶电泳基本装置使多个样品的分离同时进行,结合毛细管凝胶电泳的优势使分离在超薄层凝胶(<100μm厚)中进行从而提高电场缩短分离时间。Smith等提出使用50～100μm凝胶板配备流水冷却装置,提高场强到250V/cm,大幅提高了电泳速率,应用激光荧光CCD 检测器检测,18个样品平行电泳仪器测序效率达到8000bp/h以上,检出限1.2～3.3×10-17mol/L。另外一种基于超薄层板凝胶电泳的非连续的缓冲液系统—硼酸盐EDTA-缓冲液系统被采用[2],能解决GC丰富区和迁移带现象,明显提高了分析速度和分辨率。

超薄层板电泳采用非凝胶基质,由于横向扩散,易使泳道之间交错,曾有人试采用质量分数为20%～30%聚丙烯酰胺高粘度溶液,板厚100μm,电场强度33～100V/cm用溴乙啶和YoYo-1荧光试剂标记,电泳分离DNA性片段,获得部分分离,电泳图谱不清晰,效果欠佳,要满足人基因组项目DNA 测序速度需要,仍须进一步研究及开发。

2　直接测序技术

目前DNA序列分析主要基于电泳分离技术,随着美国HGP计划用于发展新技术的投资逐年增加,世界许多分子生物学实验室都在致力于新的DNA 测序方法的研究。

2.1　质谱法[2,18]

质谱法采用负离子快原子靶和等离子体解吸产生DNA离子化形态进行质谱测定。

电喷离子化和基体协助激光解吸离子化(matrix -assited laser desorption and ionization,MALDI)新技术的发展已成功用于蛋白质及多肽分子。MALDL-

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第1期　　　　　　　　　　　　　　　　　郜　虹等:DNA序列分析飞行时间质谱用来检测双脱氧循环产生的DNA片段的序列已部分成功。目前又发展了一种延迟离子抽提技术DE-MALDI提高MALDI的分析精度。循环测序过程中每一特异的双脱氧末端片段检出限为1×10-10mol/L,速率可达100bp/s。具有比传统方法更加快速的优势。

2.2　杂交法(Sequencing by hybridization,SBH)

杂交法测序[34]是有希望用于快速DNA测序的一种新技术。用已知序列长的寡核苷酸探针,杂交到待测DNA样品上,寻找靶DNA链上的互补序列,形成完全互补的双链,根据杂交情况排列出样品的序列信息。该技术的可行性在于严格控制杂交条件时,不同序列的探针可与目的DNA片段形成稳定的双链,特别适用于检测特殊基因的序列。

SBH有两种方式[35]:一种将目的DNA固定于一载体上,然后用一套探针逐一杂交,需大量操作步骤,另一种以点阵的方式将探针固定于载体表面,而每点探针序列已知,然后目的DNA与其点阵杂交只需一次操作。这种杂交方法关键是寡核苷酸点阵的制备,其中一种较有前途的方法是光引导合成微型高密度的寡核苷酸探针点阵。寡核苷酸点阵的用途不仅仅局限于基本的测序,由于单碱基的改变可使杂交方式多样化,寡核苷酸点阵将为效验某一被测DNA序列的正确性或寻找DNA序列中某些变化提供一个有效的工具。

近些年由于在杂交检测中引入化学发光物质代替了传统所用的显色反应大大改善了系统的灵敏度,从而将核酸的非同位素标记与检测技术提高到一个崭新的水平,被愈来愈多的实验室采用[36]。核酸发光检测就是将作为探针的核酸分子连接上可与某些特异的酶结合的配基,或直接连接。利用这类酶催化荧光底物所产生的化学发光效应,以确定核酸探针杂交的位置。化学发光检测系统具有操作安全、对人体无辐射损伤、标一次可长时间使用等优点。而且其灵敏度也不低于P。应用上除Southern Northern转移外,也可用于斑点杂交和原位杂交。只是操作稍繁,标记物的定量也较麻烦。即使如此,化学发光技术仍有可能逐步代替放射性同位素在核酸杂交中的应用。

1998年报道荧光共振能量转移(FRE T)技术应用在测定核酸杂交上取得成功,已经可以测定100μL体积中10-18mol数量级的杂交反应,与放射分析具有相当的灵敏度,却避免了繁琐的分离手续[37]。

杂交法也有其缺点,它不能测定重复序列和简单序列,如(G-T)n、PolyA序列以及微卫星DNA序列,但可确定重复单位的长度、重复单位的重复数等重要信息,并有助于序列测定后的排序。在目前技术上杂交法具备了大规模应用的可能性,甚至可以直接在固相面上平行合成寡核苷酸探针,用同聚焦的激光荧光显微镜加上敏感的检测器,在几分钟内即可检测完集成块的荧光标记杂交信号。目前许多国家研究机构采用微组装技术研究开发DNA芯片,并应用于基因分析及诊断。我国自行研制并已批量生产的第一代疫苗型DNA芯片将于2000年6月推向市场。SBH作为一种快速自动化的测序方法,在未来大规模测序以及分子生物学和基因诊断中将发挥重要的作用。

2.3　原子探针显微镜

扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜(AF M)新技术的发展,使快速、高分辨直接观测DNA分子构象成为可能。STM采用导电探针扫描样面表面,通过连续移动的探头与分子表面之间形成的隧道电流确定样品三维图象。通过STM成功地观测到DNA双螺旋结构和单个碱基对,单链分子中的单个核苷酸,根据扫描速度DNA测序能达到1000bp/ min以上。AF M是通过测量探针和DNA样品表面间的作用力,来确定分子表面形状,不要求样品导电。

原子探针显微镜具有直接观测DNA序列的能力,是一种新的高速DNA测序方法,但目前仍处于探索阶段。

2.4　流动式单分子荧光检测法

美国Los Ala mos国家实验室Keller等发展了一种快速测序的新技术,可对单个分子进行检测。在单链DNA片段的碱基上均标记不同的荧光基团,置于液流系统中用水流载带DNA片段流动,再用外切酶依次快速切断DNA中标记的每个碱基,依次用激光荧光检测,得到DNA序列,测序速度可达100～1 000bp/s,但其测序速度受酶切速度所限。目前该法用于检测单个荧光分子上取得一些进展,如检测流动式样中单个罗丹明6G分子荧光[38],流动样中单个罗丹明110分子荧光寿命数据的分析等,但这些技术还没完全应用到实际工作中,仍处于研究阶段。

DNA测序的研究工作历经数十年,在对原有技术进行不断改进完善的同时,亦致力于发展更快速、

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简便、经济的高速测序新方法、新技术。人类基因组项目的成功完成正迅速推动着人类疾病的DNA诊断及基因治疗的研究。基因作为药物的时代已来临,DNA测序技术的不断发展对研究和开发生物分子医学及分子药物学将带来不可磨灭的价值和前景。

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第1期　　　　　　　　　　　　　　　　　郜　虹等:DNA序列分析

DNA SEQUENCE ANALYSIS

G ao H ong 　Yao C heng

College of Science ,Nanjing Univers ity of Chemical Technology ,

Nanjing ,210009,China

Ouyang Pingkai

College of Life Science and Pharmacy ,Nanjing Univers ity of Chemical Technology ,

Nanjing ,210009,China

A bstract 　A revie w is given on the technology of DNA sequence analysis .The analytical methods such as capillary elec -trophoresis ,multiplexed array capillaries electrophoresis ,integrated capillar y electrophoresis chip ,mass spectrometry ,atom force microscopy ,

sequencing by hybridization and single molecular detection were commented .Key words 　DNA 　electrophoresis 　sequence analysis

简　讯

1999年被国际检索论文作者名录

SCI (11篇)排名106位

化工学院:李世光4　徐南平2　武文良

理学院:王镇浦　杨宗海材料学院:吴学权机械学院:桑芝富

国际被引(CITA )(9篇11次)排名99位

材料学院:邓敏2　严峰2　李远强理学院:王镇浦2　樊爱龙化工学院:杨超2　黄培

EI (25篇)排名56位

机械学院:周剑秋4　涂善东2　巩建鸣2　戴树和　桑芝富　沈复中　业成

化工学院:李世光3　徐南平　王仁远　云志　王沛　武文良材料学院:吴学权　马振华　周洪庆　张云灿制药与生命科学学院:范伟平

ISTP (2篇)排名173位

机械学院:蒋军成材料学院:马振华

(学报编辑部)　　　　　　

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