成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究!

510282广州第一军医大学珠江医院姜晓丹徐如祥张世忠邹雨汐徐强柳晓秋

摘要为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性，无菌条件下行骨穿，梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞，以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养，确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况；以NESTIN、NSE 及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF（20ng/mI）、LIF （10ng/mI）和RA（0.5"g/mI）等。结果发现，成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞，后者形成细胞球（或称“神经球”），该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原；若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养，单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化，可见到有的细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系，表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞；用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性和有效性。

关键词骨髓细胞；神经干细胞；细胞分化；细胞培养

中国图书资料分类号@254

STUDY ON INDUCTION AND DIFFERENTIA TION OF NEURAL STEM CELLS DERIVED FROM ADULT HUMAN BONE MARRO

Jiang Xiaodan，Xu Ruxiang，Zhang Shizhong et al.Zhujiang HospitaI，First MiIitary MedicaI University，Guangzhou510282 Abstract T o expIore the feasibiIity and vaIidity of isoIated neuraI stem ceIIs（NSC）derived from aduIt human bone marrow，the aduIt human bone marrow stromaI ceIIs，harvested by density gradient centrifugation foIIowing an iIium puncture，were cuItured in”Cytokines NSC medium”for ascertaining the optimaI survivaI conditions in uitro.ProIiferation of NSCs was evaIuated by formation of ceII cIones.Antibodies against Nestin，NSE and GFAP were chosen for identifying NSCs，neurons and gIiaI ceIIs，respectiveIy.The invoIved cytokines in cuIture incIuded GDNF（20ng/mI），LIF（10ng/mI）and RA （0.5"g/mI）.Among the aduIt human bone marrow stromaI ceIIs，there were some NSCs with rough and Iarge cytopIasmic granuIes proIiferating rapidIy in-to isIets-shaped ceIIuIar spheres with positive Nestin，a specific antigen on the fetaI neuraI epitheIium.After separating the ceIIuIar spheres into singIe ceIIs and then pIating them，we found the isIets-shaped ceIIuIar spheres appeared again.FoIIowing differentiation of the NSCs spheres，some of them formed smaII buds，which then deveIoped further into Iong projects connecting each other.Most of the ceIIs with Iong projects showed positive NSE or GFAP.It is possibIe that aduIt human bone marrow stromaI ceIIs couId be induced into NSCs under certain experimentaI conditions.AIso it impIied the feasibiIity and vaIidity that the aduIt human bone marrow might be used as the seed-ceIIs of the neuraI stem ceIIs.

Key words bone marrow ceIIs；neuraI stem ceIIs；ceIIuIar differentiation；ceII cuIture

目前已知，作为干细胞须同时具备两个基本属性：自我更新能力和产生分化细胞的能力。许多成人组织含有干细胞，当组织受到外伤、老化或疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化产生新的组织，以修复损伤，保持机体的动态平衡。但干细胞的概念直到最近才应用于成熟的中枢神经系统（CNS），这主要是由于长期受“成熟CNS神经元不具备及自我更新能力”固有观念影响的缘故［1］。近年实验研究提示，哺乳动物CNS具有同所移植胚胎神经组织形成纤维联系的能力，其中所移植胚脑神经元或神经胶质细胞可以促进受损伤大脑功能的改善，但由于受到移植组织来源、免疫排斥及伦理学等方面的，很难广泛应用于临床［2］。随着对CNS再生机制研究的深入，最近又发现成年大鼠及成人脑内均存在能够产生新神经元和神经胶质细胞的干细胞［3、4］；而动物造血干细胞也可分化成诸如骨细胞、肌细胞、血管、神经细胞等其他类型的细胞［5、6］。由此提示，如果人类造血组织也能具有这种潜在的多分化功能，特别是如果能够分化成神经细胞，那么在临床应用中将会以细胞来源充足、分化后回输自体时不存在免疫排斥及伦理学束缚等特点而占绝对优势，为以细胞替换疗法修复神经功能损害提供新的思路。本实验的目的在于探讨成人骨髓组织来源的神经干细胞诱导分化的可行性及有效性。

姜晓丹，医学博士，教授，硕士生导师。主要从事神经干细胞分化与临床应用研究、中枢神经系统损伤与修复机制研究。已发表论文20余篇，参编学术专著3部，获广东省科技进步三等奖1项。

!全军医学科研“十五”计划重大课题（编号01Z054）；广东省自然科学基金项目［粤科基办（2000）25］；广东省科技计划项目［粤财企2001（367）］

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1材料与方法1.1取材及对象成人骨髓取自骨髓捐献志愿者（23~39岁）。1.2实验主要试剂胶质源性神经营养因子（glia-de-rived neuronutrition factor ，GDNF ），维甲酸（retinoic acid ，RA ），巢蛋白抗体（Nestin ），神经元特异性烯醇化酶抗体（neuron-specific endase ，NSE ），胶质原性纤维酸性蛋白抗体（glial fibrillary acidic protein ，GFAP ），二抗试剂盒（含同

种动物血清，生物素化羊抗小鼠IgG/羊抗兔IgG ，链霉亲

和素-生物素-过氧化酶复合物），3，3-二氨基苯联胺（3，3-

diaminobenzidine tetrahydrochloride ，DAB ），盐酸丁二胺（pu-

trescine ），胰蛋白酶（trypsin ，bovine pancres ），乙二胺四乙

酸钙钠盐（calcium complex disodium ，EDT A ），细胞分离液

（cytoseparation medium ，CSM ）等。以上试剂主要为Sigma

公司、Gibco 公司、博士德公司产品。

1.3血清制备无菌抽取前臂静脉血10ml 置于无菌离

心管中，4C 条件下静置约30min 至血凝块形成及血清析

出。留取血清约4ml ，56C 水浴摇床灭活30min 后备用。

1.4骨髓获取髂前上嵴部位皮肤常规消毒，1%利多

卡因2ml 局部浸润麻醉，骨髓穿刺针抽取5~6ml 骨髓

血，快速置于含肝素无菌离心管中，4C 条件下转至11

10000级层流细胞培养室处理。以细胞分离液梯度离心

（

2500r /min ，15min ），取骨髓源细胞层（bone marrow stroma

cells ）并分作“对照组”、“RA （0.5!g /ml ）+GDNF （20ng /ml ）

组”及“LIF （10ng /ml ）”组，分别种植于12孔标准培养皿

中，悬浮于“CYTOKINE ·神经干细胞培养液”内（由本实验

室调配制成，专利申请中）置5%CO 2孵育箱培养（37C ）并

在细胞球形成后分离成单细胞悬液进行连续培养。CK2

型倒置显微镜（Olympus ）追踪观察，拍照。

1.5神经干细胞及其分化鉴定本实验主要结合克隆

形成及Nestin 抗原表达鉴定神经干细胞，以NSE 、GFAP

抗原表达分别鉴定分化形成的神经元及星形胶质细胞，

免疫细胞化学检测采用SABC 改良方法进行。各组培养

细胞经4%多聚甲醛固定，0.01mol /L PBS 冲洗，一抗37C

60min ，（其中小鼠抗Nestin 112000，兔抗NSE 11200，小鼠

抗GFAP 11200），生物素化二抗（羊抗小鼠IgG/羊抗兔

IgG ）室温孵育10min ；链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合

物（strept avidin-biotin-perxidase complex ，11200）室温孵育

10min ；DAB 显色5~15min ，Olympus 光学显微镜观察、拍

照。

2结果

2.1对照组与LIF 组此两组的实验结果相类似。细

胞接种于培养皿即刻，所有细胞呈圆球状分散悬浮于培养液中（图1a ，

插页）。培养第8天，有的细胞胞体变大，并可见到细胞出芽或现象，明显与其他小圆形骨髓

源细胞不同，后者胞体小且折旋光性强，无明显的胞质颗

粒（图1b ，插页）。培养第11天，有典型的细胞球/细胞团

形成，组成细胞球（团）的细胞数为5~8个不等（图1c ，插

页）；其细胞球（团）结构致密，隆起生长，组成细胞球的细

胞圆润饱满，含明显的粗大胞质颗粒，呈较佳活力状态；

经鉴定，该类细胞球（团）表达特殊的胚胎神经干细胞

Nestin 抗原

（图1c 小插图，插页）；进一步将这些细胞球以0.02%EDT A /0.25%胰蛋白酶液轻轻吹打分离成单细胞悬液传代培养，单个的细胞又很快变成类似原代培养时出现的新细胞球。培养第15天，有的细胞球进一步分化出一些有长突起的细胞（图1d ，插页）。培养第16~20天，大多数的长突起细胞呈现典型的神经细胞样形态，并相互延伸、连接、交织成网（图2a 、b 、c 、d ，插页）；经鉴定，这些有突起细胞可以表达NSE 或GFAP 抗原。实验中还发现，变圆变大的骨髓源性神经干细胞有时还可以不经过干细胞克隆球阶段而直接分化为典型的神经细胞样细胞。后者胞体饱满，胞突由典型的轴丘样结构伸出，并逐渐延长、变细、交织成网（图3a 、b 、c ，插页）。2.2“RA +GDNF 组”细胞接种于培养皿即刻，所有细胞呈圆球状分散悬浮于培养液中。1周左右时，有类似成纤维细胞的大细胞及多个具梭状突起的细胞出现，后者于前者的附近生长，生长方向与长轴一致；待培养到第16天左右，那些平行排列生长、拥有梭状突起的细胞数量明显增多并成束地紧密排列于类成纤维细胞周围（图4a ，插页）。培养22天（图4b ，插页），在含有梭状突起的细胞中，有的分化为突起末梢细长的典型的双极神经元样细胞，NSE 免疫组化检查阳性。3讨论从传统的发生生物学观点来看，成年受损伤大脑不具备结构上有意义的自身修复功能，成脑细胞一旦受损就不能再生新的神经元。然而，近来发现CNS 部分细胞具有自我修复和分化为3种类型成脑细胞（神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞）的能力，这些细胞符合干细胞特性并被称作神经干细胞［7］。作为一种具有复制和分化功能的母细胞，神经干细胞比一般胚脑组织更容易与宿主大脑组织整合、发育，对其进行培养并移植可治疗多种中枢神经系统疾病［8］，但目前迫切需要解决神经干细胞的来源问题。已有实验小组从成年大鼠纹状体中成功地分离出神经干细胞［3］，但迄今为止，有关骨髓组织诱导分化为神经干细胞方面的研究，仅有部分国外学者涉足［9］，国内还多停留于媒体报道及论文综述阶段，尚未发现有关骨髓组织直接向神经干细胞方面诱导分化的报道。我们的前期动物实验表明，在一定条件下，不但胚鼠室管膜·

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细胞可以诱导分化成神经干细胞，由成鼠骨髓细胞也可

以得到神经干细胞［6］，这些前期实验结果为进一步用人

骨髓进行神经干细胞诱导分化奠定了基础。

本实验以成人骨髓组织作为神经干细胞诱导分化

的种子细胞来源，在实验室特制“CYTOKINE

·神经干细胞培养基”的培养下进行了神经干细胞诱导。结果发现，在

未加有其他细胞因子的培养基中，LIF 组与对照组的各

实验时间点结果相类似，在培养到1周左右，

即可见到有细胞胞体变大、出芽或现象，随之出现表达Nestin 抗

原的细胞球（团）。提示：!骨髓源细胞在特定的神经干

细胞培养液中具备形成神经干细胞的潜力和特性；"本

研究所用的特制培养基在骨髓细胞向神经干细胞培养分

化过程中发挥了重要作用；#实验中所采用的培养条件

可以保证神经干细胞的生成与存活环境。进一步将这些

细胞球分离成单细胞悬液传代培养，发现单个的细胞又

很快变成类似原代培养时出现的岛屿状细胞球，充分显

示了神经干细胞有别于一般神经细胞的增殖特性。继续

培养使其分化，则有的细胞球（或未形成球的神经干细

胞）进一步分化形成一些可以表达NSE 或GFAP 抗原的

长突起细胞，其长突起相互延伸、连接、交织成网，表明原

有的神经干细胞具有分化为神经元及神经胶质细胞的潜

能，也进一步证实了神经干细胞的多分化性特性。从本

实验所显示的骨髓源性神经干细胞发育分化过程中，还

可以得到如下启示：在进行移植治疗时，即使没有达到能

够进行体外神经元定向诱导分化的程度，也可以考虑移

植以神经干细胞阶段为主的体外培养细胞（主要包括大

圆形神经干细胞和神经细胞球，可间或有少量分化细

胞），其进一步的分化则主要依靠体内微环境诱导。

此外，本实验LIF 组与对照组各时间点结果相似，

提示LIF 这种经典意义上本应具有

“促干细胞增殖、抑制干细胞分化”作用的细胞因子，对神经干细胞并未发挥应有

的“抑制细胞分化”作用，表现为即便在实验过程中加入

5~10ng /mI 的LIF ，仍不能阻止由神经干细胞（球）分化出带有典型长突起的神经元/神经胶质细胞样细胞。其具体原因不明，分析可能是LIF 不但可以调节神经干细胞增殖，在特定实验条件下（如不同浓度或培养环境等发生变化时）也可启动神经干细胞、分化信号；或者是实验还没有达到LIF 抑制神经干细胞分化的最佳浓度；还有一种可能则是LIF 对神经干细胞的分化并不具备抑制作用。在RA +GDNF 组，细胞接种培养约1周后，即出现有类似成纤维细胞的大细胞及多个具梭状突起的细胞；从细胞生长过程来看，随着细胞的进一步培养，梭状突起细胞一般都于类成纤维细胞附近成束地紧密排列生长，且此两种细胞间呈与长轴一致的方向平行排列；而随着细胞培养时间的延长，在含有梭状突起的细胞中，有的分化为典型的突起末梢细长的双极神经元样细胞，NSE 免疫组化检查阳性。本实验结果表明，以成人骨髓组织作为神经干细胞来源是可行及有效的，为将来以人骨髓源性神经干细胞作为种子细胞进行自体细胞移植提供了实验依据。参考文献1T empIe S.The deveIopment of neuraI stem ceIIs.Nature ，2001，414：1122姜晓丹，徐如祥，张世忠.胚胎干细胞研究与发展前景.美国中华内科学杂志，2001，3（4）：2453刘仕勇，张可成，杨辉等.神经干细胞的分离培养及其鉴定.第三军医大学学报，2000，22（1）：2BjorkIund A ，LindvaII O.SeIf-repair in the brain.Nature ，2000，405：25Krause DS ，Theise ND ，CoIIector MI et al.MuIti-organ ，muIti-Iineage en-graftment by a singIe bonemarrow-derived stem ceII.CeII ，2001，105：3696姜晓丹，徐如祥，张世忠等.胚鼠室管膜及成鼠骨髓神经干细胞分离培养及分化鉴定实验研究.中国临床神经科学，2002，10（2）：1257Barinag M.FetaI neuron grafts pave the way for stem ceII therapies.Science ，2000，287：14218Mckay R.Stem ceIIs in the centraI nerve system.Science ，1997，276：669Gage FH.MammaIian neuraI stem ceIIs.Science ，2000，287：1433（2002-08-14收稿）

（本文编辑曾星胡全兵）

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成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

作者：姜晓丹， 徐如祥， 张世忠， 邹雨汐， 徐强， 柳晓秋

作者单位：510282,广州,第一军医大学珠江医院

刊名：

医学杂志

英文刊名：MEDICAL JOURNAL OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY

年，卷(期)：2002,27(11)

被引用次数：27次

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