微生物限度检查方法及其验证报告
1 样品相关信息
基本信息
2 主要仪器设备和试验耗材信息
主要使用的仪器设备
试验用培养基
试验用试剂
试验用菌种
3 试验环境
无菌室
洁净工作台
生物安全柜
4 试验方案
验证试验目的
微生物限度检查方法草案
5 方法验证试验
菌液制备
计数培养基适用性检查
控制菌检查用培养基使用性检查
供试液制备
方法验证
菌落计数方法验证试验
控制菌检查方法的验证
方法验证结论
6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息
基本信息（三批）
| 品名 | 多烯酸乙酯软胶囊 或 蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸 | ||
| 规格 | 粒，30粒/瓶 或粒，30粒/瓶 | ||
| 批号 | |||
主要使用的仪器设备
| 仪器名称 | 型号 | 编号 |
| 培养箱 | HH·BⅡ·360 | ZL-025 |
| MJX-150 | ZL-042 | |
| SPX-150B | ZL-046 | |
| JJ-5 | ZL-026 | |
| 电子天平 | JY1001 | ZL-013 |
| 超净工作台 | JH-DCB | ZL-028 |
| 生物安全柜 | BSC-1100ⅡA2 | ZL-029 |
对照培养基
| 培养基名称 | 批号 | 生产厂家 |
| 胰酪大豆胨琼脂培养基 | 中国食品药品检定研究院 | |
| 胰酪大豆胨液体培养基 | ||
| 沙氏葡萄糖琼脂培养基 | ||
| 沙氏葡萄糖液体培养基 | ||
| 麦康凯液体培养基 | ||
| 麦康凯琼脂培养基 | ||
| RV沙门增菌液体培养基 |
| 培养基名称 | 配制批号 |
| 胰酪大豆胨琼脂培养基 | |
| 胰酪大豆胨液体培养基 | |
| 沙氏葡萄糖琼脂培养基 | |
| 沙氏葡萄糖液体培养基 | |
| 麦康凯液体培养基 | |
| 麦康凯琼脂培养基 | |
| RV沙门增菌液体培养基 |
| 试剂名称 | 配制批号 |
| 含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 | |
| 含%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 | |
| %氯化钠 | |
| 1%红四氮唑 |
| 菌种名称 | 菌种编号 | 工作用菌种批号及代数信息 |
| 大肠埃希菌 | CMCC（B）44 102 | E3-02 |
| 枯草芽孢杆菌 | CMCC（B）63 501 | E3-02 |
| 金黄色葡糖球菌 | CMCC（B）26 003 | E3-02 |
| 乙型副伤寒沙门菌 | CMCC（B）50094 | E3-02 |
| 白色念珠菌 | CMCC（F）98 001 | E3-02 |
| 黑曲霉 | CMCC（F）98 003 | E3-02 |
《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
无菌室
无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
超净工作台
超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录
| 沉降菌落数 | 左 0 中 0 右 0 空白对照 0 |
生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录
| 沉降菌落数 | 左 0 中 0 右 0 空白对照 0 |
按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
验证试验目的
确认所采用的方法适合于本品的微生物限度检查。即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
微生物限度检查方案
对三批产品进行3次的平行试验。 取本品10g，加含1%聚山梨酯80
的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：
10的供试液。取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：100的供试液。微生物计数法，取1：10的供
试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌
检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检
查（中国药典2015年版四部通则1106）。
5 方法验证试验
对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行验证。
菌液制备
（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天。上述培养物用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3ml %聚山梨酯80的 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
计数培养基适用性检查
（实验时间：）
取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养3～5天，计数；取上述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养5～7天，计数；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。试验结果如表1：
表1 培养基适用性检查结果
| 金黄色葡萄球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 大肠埃希菌 | 黑曲霉 | 白色念珠菌 | ||
| 对照培养基 | 1 | |||||
| 2 | ||||||
| 平均 | ||||||
| 被检培养基 | 1 | |||||
| 2 | ||||||
| 平均 | ||||||
| 回收率% | ||||||
| 菌落形态大小是否一致 | ||||||
| 结果判断 | ||||||
（实验时间：）
控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基适用性检查
麦康凯液体培养基促生长能力和抑制能力检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。
麦康凯琼脂培养基促生长能力和指示特性检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌与被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～72小时，结果见表2。
表2 控制菌检查用培养基适用性检查结果
| 检测项目 | 培养基 | 试验用菌 | 促生长能力 | 抑制能力 | 指示特性 | |||
| 对照培养基 | 被检培养基 | 对照培养基 | 被检培养基 | 对照培养基 | 被检培养基 | |||
| 大肠埃希菌 | 麦康凯液体培养基 | 大肠 | + | + | / | / | / | / |
| 金葡 | / | / | + | + | / | / | ||
| 麦康凯琼脂培养基 | 大肠 | + | + | / | / | + | + | |
| 结论 | ||||||||
供试液制备
（实验时间：）
取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：100的供试液。
方法验证
（实验时间：）
菌落计数方法验证试验
（1）菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表3。
（2）供试品对照组：取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表4。取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定结果见表4.
（3）试验组：取1：10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml（小于100cfu试验菌）分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。另取1：10的供试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（不大于100cfu试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
（4）稀释剂对照组：取1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定结果见表7。
上述已注入供试液的平皿（其中试验组在注入供试液和控制菌菌液后应立即倾注培养基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养3～5天逐日观察结果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后，置20～25℃培养5～7天逐日观察结果。
表3 菌液组菌落计数（cfu/皿）
| 大肠埃希菌 | 金黄色葡萄球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 白色念珠菌 | 黑曲霉 | |
| 1 | |||||
| 2 | |||||
| 平均 |
| 试验次数 | 需氧菌总数 | 霉菌和酵母菌总数 | ||
| 1ml | 平均 | 1ml | 平均 | |
| 1 | ||||
| 2 | ||||
| 3 | ||||
试验
| 次数 | 大肠埃希菌金 | 黄色葡萄球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 白色念珠菌 | 黑曲霉 | |
| 1 | 1 | |||||
| 2 | ||||||
| 平均 | ||||||
| 2 | 1 | |||||
| 2 | ||||||
| 平均 | ||||||
| 3 | 1 | |||||
| 2 | ||||||
| 平均 |
表6 试验组回收率测定结果
| 试验次数 | 回收率% | ||||
| 大肠埃希菌 | 金色葡萄球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 白色念珠菌 | 黑曲霉 | |
| 1 | |||||
| 2 | |||||
| 3 | |||||
| 试验次数 | 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 | 1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 |
| 1 | ||
| 2 | ||
| 3 | ||
| 平均 |
控制菌检查方法的验证
（实验时间：）
菌液制备
接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时。用%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu~100cfu菌悬液。
大肠埃希菌检查方法的验证
（1）供试品组：取1：10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（2）阴性对照组：取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（3）取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置43℃培养24小时，观察结果，见表7。
表8 大肠埃希菌检查结果
| 大肠埃希菌 | ||
| 胰酪大豆胨液体培养基 | 麦康凯液体培养基 | |
| 供试品组 | ||
| 阴性对照组 | ||
方法验证结论
上述验证试验结果证明，非无菌产品微生物限度检查方法方案可行。依据验证结果，制定非无菌产品微生物限度检查方法如下：
微生物限度 取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白
胨缓冲液至100ml，使供试品分散均匀，制成1：10的供试液。必要时，取1：
10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml
中，即为1：100的供试液。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1：10的
供试液1ml，注皿，微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法
检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液
10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部
通则1106）。
1g供试品中，需氧菌总数不得过100cfu，霉菌和酵母菌总数不得过10cfu；不得检出大肠埃希菌。
6 供试品微生物限度检查结果
按照上述确定的非无菌产品微生物限度检查方法检验三批供试品，结果符合规定，结果见下表。
| 批号 | 需氧菌总数（cfu/g） | 霉菌和酵母菌总数（cfu/g） | 控制菌检查 |
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