02微生物实验室菌种管理规程(3.11审核) 2

2、适用范围：微生物试验用菌种的管理。        

3、责 任 者：质检科负责人、微生物试验人员、菌种管理人员

4、正    文：

4.1概念

a、标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。

b、标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。

c、商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。

d、工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。

e、代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。

4.2菌种的采购和接收

4.2.1菌种的采购

4.2.1.1从药检所或菌种保藏中心等外单位购入菌种斜面或冻干菌种。

4.2.1.2根据工作需要对购买国内保藏中心提供的菌种斜面提前1个月填写采购申请单，冻干菌种提前2个月申请购买，国外保藏中心提供的菌种应提前3个月申请购买。

4.2.2菌种的接收

4.2.2.1检定菌应设专人保管，管理人员应接受过专业培训，有足够的菌种保存经验。

4.2.2.2接收菌种时，应核实菌种的名称、编号、传代代数、数量、有效期等，并调查清楚菌种的保存条件和注意事项。

接收时应填写菌种接收登记表。内容包括：菌种名称、菌种保藏中心编号、传代次数、接收日期、菌种来源等。

4.2.3对新购入的冻干菌种在使用前应按要求对其进行生物形态确证试验和纯度鉴定，由于新购买的菌种斜面已由菌种提供单位做过生物形态确证试验和纯度鉴定，所以传代5代以内的菌种斜面不需要进行纯度鉴定。

4.2.4对新购入的斜面菌种应在2～8℃保存，并应在1周内转接。

4.3菌种的复苏

4.3.1使用人员根据需要应向菌种管理人员领取菌种，仔细核对标签上菌名、编号，并在《菌种接收及领用登记表》上记录菌名、数量、领用人、领用日期等信息。

4.3.2菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用。

4.3.3菌种复苏应在生物安全柜内操作。

4.3.4常用菌种接种用培养基和培养条件表

4.4.1每株菌种应建立菌种使用及传代记录，斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔。

各类斜面菌种保藏温度与传代间隔时间表

4.4.2传代时使用须核对名称、编号，传代代数及日期，所用培养基传代和接种规程

4.4.2.1控制传代次数，传代次数越多，突变的几率越大，因此要尽量少传代；根据菌种特性和实际保存情况，最多传代不超过5代，超过此次数，应加热灭活，菌种有异常情况或有杂菌生长，则应随时更代。

4.4.2.2菌种的传代应在生物安全柜中进行。

4.4.2.3在规定的保存期内,取 5代以内的菌种管（琼脂培养基斜面培养物） ，取其中1支重复接种斜面培养基，制备下一代工作菌种用于传代。

4.4.3传代和接种规程

4.4.3.1 先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。

4.4.3.2 再将原有的菌种斜面培养基（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后，应斜持试管呈45°角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。

4.4.3.3首先，以右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易于拔取。再以右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。环以上凡接种时可进入试管的部分，也应通过火焰烧灼。烧灼时，应把环置于酒精灯的外焰上，因外焰的浓度比内焰高，容易烧红。

4.4.3.4使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞，持住，再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。

4.4.3.5先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基土，如有熔印则表明接种环未冷却能烫死细菌。一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许，取出时接种环不能通过火焰，应从火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时，一般先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。

4.4.3.6 当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。最后将接种环烧灼灭菌放置原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可进行培养。

4.4.3.7 操作过程中，如因不慎使棉塞触及火焰而着火，却勿用口吹，须在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不足会很快熄灭。若棉塞外端着火，可用手捏熄。若棉塞烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基上的灭菌棉塞，代替塞上。

4.4.3.8接种完毕, 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙门菌、生孢梭菌在30-35℃培养18-24小时，白色念珠菌在23-28℃培养24-48小时，黑曲霉在23-28℃培养（5-7天）。

4.4.3.9传代和接种使用后，应填写菌种传代、使用记录，并记录传代菌种实验室编号。 实验室菌种编号由以下内容组成：传代日期（年两位＋月两位＋日两位）+ 传代代数（一位数字）+序号（两位数字）

如： 130312-4-01表示13年3月12月接种的第1支菌种管

4.4.3.10最后贴上标签，标签应有菌种名称、保藏中心编号、实验室编号、有效期。

4.5菌种的保藏

4.5.1冻干菌种在低温冰箱-20℃冷冻。

4.5.2为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成无菌橡胶塞，放在2℃-8℃左右的冰箱内保藏。

4.5.3 在保藏前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。

4.5.4每天检查一次保存菌种的冰箱温度，并作记录，每周检查菌种管的棉塞是否松动，菌种外观及干燥状态，如有异常应及时处理，并填写菌种检查记录。

4.5.5每次移植培养后，要与原种的编号、名称逐一核对，确认培养特征和温度无误后，再继续保存。

4.6菌种的使用和销毁

4.6.1受污染的菌种、过期菌种或菌种传代使用后应及时销毁，销毁时应经121℃高压蒸汽灭菌30分钟的生物灭活处理。

记录、附录、参引文件清单