分子生物学技术在环境微生物

研究中的应用

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分子生物学在环境微生物

研究中的应用

摘要:介绍了在环境微生物研究中的分子生物学技术,如核酸探针技术、聚合酶链式反应技术、电泳分离技术、基因重组及基因芯片技术等以及这些相关技术在环境微生物分类、环境微生物监测和环境微生物治理污染中的应用。结果表明,分子生物学技术在研究环境微生物中发挥了重要作用。

关键词:环境微生物；分子生物学技术；应用。

1、引言

分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学。近年来,随着分子生物学的迅速发展,其相关的研究技术已日臻完善。已经渗透到生命科学及环境科学的多个已经领域。自80年代以来,随着人类生活的进步和工农业生产的迅速发展。新的环境问题,如全球气候变暖、生物多样性锐减、生态系统退化。人类赖以生物圈受到广泛污染。大量人工合成的并难以被天然微生物迅速降解转化的污染物进入自然环境中,严重威胁人类及其它生物正常的生存和发展。其中,普遍存在与土壤环境中的重要有机污染物如多环芳烃、含N杂环化合物等。因其具有较高的致癌性、致畸性、致突变性而被认为是只要的污染物质。因此,快速、高效地监测、治理环境污染,已成为世界各国普遍关注的热点问题。分子生物学技术为环境污染的治理及环境微生物的监测及环境微生物的多相分类提供了快捷、准确、有效的方法。

2、与环境微生物研究相关的分子生物学技术

2.1、核酸探针检测技术

核酸探针检测技术属于分子标记技术, 利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针分析 DNA序列及片段长度多态性,被标记(放射性或非放射性 )的探针根据碱基互补配对原则,以原位杂交、Southern印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法,可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法灵敏性, 使得核酸分子杂交广泛应用于对环境微生物的检测。定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。

2.1.1、荧光原位杂交( FI SH )技术

荧光原位杂交技术的原理是用荧光染料标记基因探针,再使标记的探针与前期固定在载玻片上的微生物样品杂交,洗去未杂交部分后借助荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜进行观察和摄影。该技术可同时对不同类群的微生物在细胞水平进行原位的定性、定量分析和空间位置标示。目前,可通过 FI S H技术,利用一整套特异的寡核苷酸探针可进行单个微生物细胞的快速分类检测。

2.1.2、性片段长度多态性标记

性片段长度多态性是基于Southern印迹杂交的技术, 是在微生物多样性研究中广泛应用的DNA分子标记技术。是利用放射性同位素或某些非放射性标记探针与转移于支持膜上的基因组总DNA (经性内切酶消化 )杂交, 通过显示性酶切片段的大小来检测不同遗传位点变异的一种技术。应用特定的核酸内切酶切割有关的 DNA分子, 经过电泳、原位转膜印迹、探针杂交、放射性自显影后,分析与探针互补的 DNA片段在长度上的简单变化, RFLP多态性来源于突变造成的决定片段数量的的性内切酶位点的存在与否。两个酶位点间因 DNA插入、重排或缺失造成的长度差异。RFLP标记分辨率高, 共显性表达,在非等位基因之间不存在上位效应, 具有很好的重复性和准确性,被广泛应用于基因定位、指纹分析、确定亲缘关系、遗传多样性分析等方面, 是发现最早,具有代表性的DNA分子标记技术。它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠方法,同时,可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法[ 7]。

2.1.3、随机扩增多态性标记

RAPD是1990年美国杜帮公司的科学家J .G .K . Williams和加利福尼亚生物研究所J .welsh两个研究小组几乎同时发展起来的检测DNA多态性技术，其通过PCR扩增的产物在正常情况下可被视为基因组上的一个位点，就某一特定引物而言,它与基因组结合位点的序列互补,决定了扩增产物具有一定的特异性,如果不同个体在结合位点上的序列因突变存在差异, 或两个结合位点间由于 DNA序列的插入、缺失造成距离变化,就会形成扩增产物的出现或长度变异等多态现象。RAPD技术可在各种生物没有任何分子生物学研究的情况下进行DNA多态性分析, 构建基因指纹图谱等研究。PAPD技术所需模板 DNA的量极少, 只要其中有特定的 DNA片段,就可扩增该片段。由于引物设计是随机的人工定序合成,一套引物可用于多个物种的基因组 DNA多样性分析,基于以上特点, RAPD自发明以来被广泛应用于各类的生物研究。同时, 在环境微生物的分类研究中也得到广泛应用。

2.2、聚合酶链式反应及相关技术

PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA的复制过程,首先使 DNA变性,两条链解开; 然后使引物模板退火,二者碱基配对; 耐高温的Taq DNA聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的 DNA 新链。PCR技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。能够弥补DNA分子直接杂交技术的不足。PCR技术的产生是整个分子生物学领域的一项重大,发展极快,已衍生出一系列相关的生物技术。根据扩增的模板、引物序列来源及反应条件的不同,将PCR技术可分为以下几种:(1)反转录PCR技术(RT -PCR) ,是在 mRNA 反转录之后进行的扩增。可以用来分析不同生长时期的 mRNA表达状态的相关性。(2)竞争PCR (c-PCR), 是一种定量 PCR,通过向 PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板,控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度。对目的模板做定量研究。(3)AFLP标记,先用酶消化DNA,然后连接上人工合成的双链接头,最后进行 PCR和电泳显示。此技术是用一个短的随机引物进行PCR, 模板DNA有多个扩增子,可以扩增出多个产物而可能出现多态现象。(4) RAP- PCR:该技术基于任意寡核苷酸引物与RNA之间可能的配对, 这样的相互作用在低严谨度条件下,经聚合酶催化,使链延伸。细胞总 RNA或 mRNA作为反转录反应的模板,RAP-PCR技术可用于诊断遗传突变及分析污染条件下序列的多态性。

2.3、电泳分离及其显示方法

除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE) ,可分离长度相同但是序列不同的 DNA片段的混合物。对于特异性引物PCR扩增的环境微生物的16SrRNA基因,一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂,可以形成从低到高的线性梯度,在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物,其部分解链程度不同。DNA解链程度不同决定其电泳的迁移率,结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下,该技术能分辨一个碱基对。DGGE技术在微生物群落结构的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA同源性的分析中得到广泛应用。温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变性温度来进行分离, 最先应用于 DNA /RNA的分子构象分析和序列变异分析,是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性 ( SSCP )也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA片段在凝胶上得以高分辨率的分离。

2.4、基因重组技术

就是利用 DNA体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或 DNA片段,或经过人工合成的方法获得基因,然后经一系列切割、加工修饰、连接反应产生重DNA分子,再将其转入适当的受体细胞, 以期获得基因表达的过程。此技术用与环境微生物的研究可构建出各种生物降解特性增强的重组细菌用于污染环境的治理修复或发酵某些废弃物产生天然气。

2.5、基因芯片技术

基因芯片技术作为生物芯片技术发展最完备的分支, 近十年来, 已成为国内外研究的一个热点。基因芯片又称为 DNA芯片,还称为 DNA阵列, 是在玻片、 硅片、薄膜等载体很小的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶 DNA片段或寡核苷酸片段。这些被固定的 DNA分子在基质上就形成了高密度 DNA微阵列。根据固定在玻片上的 DNA类型,基因芯片可分为DNA芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下,载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记,在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

3、分子生物学技术在环境微生物研究中的应用

3.1、在环境微生物分类中的应用

用核酸探针技术可以发现核酸分子的同源序列,生物间亲缘关系越近, 其间的 DNA /DNA 或DNA /RNA同源率越高。其中 DNA /DNA杂交最适合种一级水平的研究。Johnson总结提出了依据DNA /DNA杂交同源性与亲源关系的判断标准, 杂交同源性为 60% ~100% , 属同一种细菌; 同源性为60%~70% ,属同一种内不同亚种;同源性为20%~60%, 属属内紧密相关的种; 同源性为小于 20%, 则属于有关的不同属。在对微生物群体进行多样性研究的方法中,大多数方法的先决条件是该群体的微生物能被分离纯化,而我们知道, 绝大多数微生物很难或无法纯培养。据统计,通常环境中,不可培养的细菌占到细菌总数的 85%~ 99.99%。即使得到纯培养, 但其形态和生理也可能发生很多变化。随着人们对环境微生物的原位生态状况的研究。发现常规的分离培养方法很难全面评估环境微生物群落的多样性,只能反映极少数微生物的信息, 从而影响我们对环境微生物种群的准确评估。DGGE、FI SH、RFLP、RAPD等分子生物学技术的引入, 使研究环境微生物生态降低了对培养技术的倚赖,为环境微生物的多样性研究提供了新的理论和方法。

3.2、在环境微生物监测中的应用

核酸杂交、PCR、多态性研究等分子生物学技术已能在DNA测序和有关结构基因分析的基础上监测和定量复杂的混合微生物群落中的一些特殊的微生物。同时,一些作为分子标记的基因工程菌也应用到环境微生物技术中这些分子生物学技术结合使用,在系统发生基础上对培养物中的微生物进行快速的测定,从而为监测自然界和基因工程体系中的菌落结构和生物多样性提供重要的依据。所以这些分子生物学技术的共同特点是特异性, 它们能快速、灵敏地检测环境微生物的结构基因并对其作定量研究,从而能准确测定微生物的活性, 有效地对环境微生物进行监测。

3.3、在环境微生物治理污染中的应用

利用微生物来治理污染快速高效, 因此,利用基因重组技术构建高效菌种来治理污染,特别是环境中复杂或难以降解的有毒有害化合物。如人工合成塑料、 除草剂、 杀虫剂等成为环境微生物技术的热点之一。如超级细菌就在石油烃污染的环境修复中发挥了重要作用;微生物分解纤维素和木质素的基因如转入到中温细菌中,使发酵能在较高温度下进行,提高转化速度, 用与发酵某些废弃物产生天然气。基因重组技术对污染物的治理、预报、修复都做出了重大贡献。

4、 结束语

随着分子生物学技术的发展和对环境微生物研究的深入,分子生物学技术在环境微生物中的应用越来越广泛也越来越重要。分子生物学技术的应用不仅扩大了环境微生物研究的广度, 而且加大了研究的深度:包括对于从自然界中挖掘到的大量具抗逆性、 高降解能力的基因资源的分子水平的研究和操作, 发掘难以降解芳香族化合物及衍生物的部分降解基因,重金属吸附基因的克隆并阐明序列结构和功能,或转入适当的宿主菌进行进一步研究。随着越来越多微生物全部基因序列的解码, 对各种细菌体内降解基因的分布和表达会有更深入的了解。这方面技术的成熟必将对环境微生物的研究有一个整体的、系统的认识,必将使研究更具有目标性,更具有可控性。

参考文献:

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[3]岳春梅, 明镇寰：.分子生物学技术在环境微生物监测中的应用 [J].微生物学通报, 2002 , 27( 3) : 215。

[4]叶亚新, 黄通, 王金虎：分子生物学技术在环境微生物多相分类中的应用 [J] .苏州科技学院学报 (自科版 ),2004 , 21( 4): 47- 53。

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[6]蕈拥灵：分子生物学技术及其在环境污染治理中的应用研究进展 [J]. 河池学院学报, 2005 , 25( 2): 24- 29。

[7]李立家, 肖庚富 ：基因工程 [M]、北京科学出版社,2004 。

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