荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测

一、背景介绍

1．绿色荧光蛋白

1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin。与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。1985到1992年间，科学家 Douglas  Prasher 测定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。

绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。

GFP的优点很多：首先，它本身稳定，不需要任何反应底物和辅助因子，且无种属，可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光，在450～490nm 蓝光激发下,发光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质，对细胞没有毒性。最后，GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。

作为一种新型的报告基因， 绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利用绿色荧光蛋白的特有发光机制，可将GFP作为蛋白标签。就是利用 DNA 重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染或转化至合适的细胞进行表达，而后借助荧光显微镜观察细胞内活体中标记的蛋白质。绿色荧光蛋白也可用于大规模药物筛选。另外，由于绿色荧光蛋白独特的光信号传导机制及其在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用影响的特性，极适用于成为活细胞体内的光学感受器。近年来，由于融合抗体具有发射荧光和与抗原结合两种特性，所以将其用做免疫染色的检测试剂，直接用于流式细胞仪、免疫荧光的标记、肿瘤的检测等。

目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent  Protein，简称EGFP）。EGFP将GFP的第位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等

EGFP (720bp)的基因片段: 

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

2.大肠杆菌表达载体及表达系统

大肠杆菌质粒是一类于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。大肠杆菌的表达系统包括：Lac和Tac表达系统，这是最早建立并得到广泛应用的表达系统，它是以大肠杆菌lac操纵子机理为基础设计、构建的表达系统。PL和PR表达系统，它是以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统称为PL和PR表达系统。T7表达系统，大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。此外还有其他表达系统，如营养型、糖原型、pH型等。

3．SDS-PAGE原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。在电泳时， SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。

一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。

4.蛋白分离与检测

蛋白质的分离方法很多，依据分子大小分离的方法包括：透析和超过滤，透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。密度梯度离心，蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。凝胶过滤，即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 

根据溶解度分离的方法包括：盐溶和盐析，中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 

根据所带电荷分离的方法包括：电泳（净电荷、分子大小、形状），区带电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳 离子交换层析。其余的方法还有吸附层析、亲和层析、高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）等。

蛋白质的检测方法包括：凯氏定氮法，它是样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。双缩尿法，双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。Folin－酚试剂法，此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。紫外吸收法，蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

5. pET28a 质粒

pET28a 质粒作为表达载体, 该质粒含有强启动子T7 启动子, 可以使目的基因得到高效表达。其N端含有Thrombin蛋白酶切位点。 Pet28a的抗性是kana抗性，通常所用的表达菌株是BL21（DE3），BL21（DE3）Gold等BL21（DE3）系列的宿主菌。

pET28a, b, c的差异仅仅存在于多克隆位点处，Pet28a和pET28b，pet28c的载体的区别是差了一个核苷酸碱基，目的是便于在进行克隆构建的时候调整氨基酸读码框，使得基因都可以克隆到这个系列目的载体中去。

pET28a：

1.实验器材及试剂

超低温冰箱、电热恒温培养箱、恒温调速摇床、PCR 扩增仪、电泳仪、高速冷冻离心机、电子天平、水浴锅、低温高速离心机、快速混匀器、EGFP-N3 模板、菌株E. coli DH5、E. coli BL21、质粒 pET28a、性内切酶 EcoRⅠ, Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒及质粒、小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉等

2.实验流程（实验中样品用量根据提取的各种载体、质粒的浓度相应的改变）

2.1碱裂变法提质粒

2.1.1细菌的培养 

1) 添加适量的抗菌素（Ap: 20 mg/mL母液——终浓度50~100 ug/mL）（避免杂菌污染，防止质粒的丢失） 

2) 接种（20 mL+Ap——50 mL+Ap）

3) 控制菌体的生长状态（37℃过夜培养或转接2－4％菌液至新鲜培养基中， 37℃继续培养至对数生长中后期）。

2.1.2细胞裂解提取质粒DNA（4℃操作，每100mg菌体量，加入）

1）称离心管重W1，加入约1/2离心管的菌液，与另一组同学配平，6000r/min离心5min。

2）弃去上清液，再加入5ml溶液Ⅰ，混匀，6000r/min离心5min，弃去上清液，称离心管重量为W2，计算菌体量△W。

3）1.0mL溶液Ⅰ，充分涡旋震荡，用溶液Ⅰ再次配平。

4）2.0mL溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，冰浴3-5min。

5）1．5mL溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀，冰浴5min。

6）12000rpm，15min；小心转移上清到新的离心管中，记录体积V。

7）加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20℃,15min。

8）12000rpm，15min，弃上清。

9）加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸弃上清液。

10）重复乙醇洗涤一次，37℃风干5-10min。

11）分次加入1mLTE溶液并转移到Ep管中，得到质粒DNA粗提物。

12）加入50ulRNase（10mg/ml），终浓度为50ug/ml，37℃孵育1-2h。

2.1.3质粒DNA的纯化

1）1ml粗提物均分于两个Ep管中，加入等体积Tris饱和酚，混匀，12000rpm离心5min。

2）转移上清V1至新管，加入V1的酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min。

3） 转移上清V2至新管，加入V2的氯仿/异戊醇溶液，混匀，12000rpm离心5min。

4）转移上清V3至新管，加入1/10V3的3MNaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30min。

5）12000rpm离心14min，弃上清。 

6）加入500ul70%乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清。

7）重复洗涤一次，吸弃上清液，37℃风干5min。

8）每管加入25ulTE溶解沉淀，合并，得到50ul纯化质粒DNA。

2.2重组质粒的构建

2.2.1 EGFP和质粒DNA的酶切    

加样顺序为：ddH2O-Buffer（缓冲液）-DNA-性内切酶 HindⅢ；在不同的1.5ml无菌离心管中，按照表1中Ⅰ、Ⅱ组样量顺序加入各组分（将少量的样品加在管壁上，确保加样准确）。样品混匀后，4000rpm离心1min，将液体集中于管底。酶切后，可以用电泳检测一下酶切的效果。

表1.性内切酶反应体系加样顺序

取无菌1.5mlEP管，加样顺序为：ddH2O-Buffer-pUC19/HindⅢ- EGFP /HindⅢ-T4DNA Ligase（见表二） 

表2.T4连接酶反应体系加样顺序

2.3.1 感受态细胞的制备（注意冰浴、４℃离心）

1．倒LB平板，划线活化E.coliDH5α，培养一段时间。挑取单菌落接种到5mlLB液体中，37℃震荡培养过夜。将过夜培养物按1%转接至新鲜20mlLB液体，37℃，220rmp震荡2-2.5h。

2．取2个干净的Ep管（编号SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp离心5min，弃上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp离心5min，弃上清。

3. 利用残留液体涡旋细胞，然后加入800μl预冷的0.1M CaCl2，冰浴悬浮细胞，随后4000rmp离心5min，弃上清。

4. 加入100μl冷0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，冰浴20min，之后将SG-1-2分装50μl至SG-1-3管中。

2.3.2 质粒转化

 按表3的序号顺序加样、操作。

表3.质粒转化

1. 观察几天前的涂布培养结果并记录，着重包括：菌落生长情况、生长的菌落的颜色、菌落数量的多少，并测量菌落的pH值。

2. 从实验组的2个50ul的平板中挑出4个白色单菌落，在事先预留的空白麦+Ap平板上分区划线培养。将接好菌的平板放在恒温培养箱中。

2.4 PCR反应

2.4.1试剂盒法提质粒

1. 观察上次划线的平板中的菌落是否为白色。用烧好的镊子夹着无菌牙签划取带有重组质粒的E.coliDH5a（白色的菌落），将带有质粒的E.coli接种于5ml LB/抗生素培养液中，37℃摇床培养12~16个小时。

2. 取1.0~5.0ml的菌液，室温下10000xg离心1min收集细菌。

3. 倒弃培养基，加入250ul SolutionⅠ/RNase A混合液，漩涡震荡使细胞完全悬浮。

4. 往重悬混合液中加入250ul SolutionⅡ，轻轻颠倒混匀4~6次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。

5. 加入350ul SolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。

6. 室温下，≧10000xg离心10min。

7. 转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，10000xg离心1min，倒去收集管中的滤液。

8. 把柱子重新装回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。

9. 把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。

注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。

10. 把柱子重新装回收集管，10000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。

注意:不要忽略次步——这对去除柱子中残留的乙醇至关重要。

11. 把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30~50ul Elution Buffer到柱子基质中，静置1~2分钟，10000xg离心1min洗脱出DNA。

2.4.2 PCR反应

在进行PCR反应之前，可以用凝胶电泳检测重组质粒，看一下重组质粒的大小，再用PCR扩增目的基因。

以EGFP 片段为模板, 设计上游引物: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’,下游引物: 5’- GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3’。可以先将模板适当稀释，实验要设置对照试验，可根据需求自主设计加入各组分后，分别取模板、上游和下游引物、Taq酶（5u/ul）、dd水、10× Buffer、dNTP作为 PCR反应体系（可参照表4加），轻弹混匀加入的液体，快速离心集液于管底。将制备好的PCR体系放入PCR机器中，PCR的反应程序如表5。

表4. PCR体系的建立

2.5重组表达载体的构建

2.5.1 EGFP 基因和 pET28 a 表达载体的性酶切处理

取上述经PCR扩增后的目的片段作为PCR反应的模板, 设计引入EcoRⅠ酶切位点的上游引物( 5’GGAG / AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’)和 引 入Hind Ⅲ酶切位点的下游引物( 5’CCGA / AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC3’)。PCR 反应体系及反应条件同2.4.2。扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检验。PCR后的EGFP片段进行双酶切, 反应体系如下: 30L添加了酶切位点的 EGFP片段、5ul 10×buffer、1ul EcoRⅠ(20 U/L)、1ul Hind Ⅲ( 20 U/L) ,用无菌水将反应液调至 50  L 后,于 37℃下保温1 h, 然后在 65℃条件下处理20min 进行热失活。另一方面, 将pET28a 质粒载体按上述方法进行双酶切。可以用琼脂糖凝胶电泳对上述两个酶切产物进行检测。

2.5.2 pET28a-EGFP重组表达载体的构建   

将上述含酶切位点的EGFP片段与线性pET28a质粒按2：1比例、在45下℃保温5 min 后, 置于冰浴中冷却,冷却后分别加入1ul T4DNA 连接酶、2ul10×T4DNA连接酶缓冲液, 37℃培养过夜。

2.6EGFP 基因的原核表达及检测  

2.6.1制备E. coli BL21感受态细胞

1．倒LB平板，划线活化E. coli BL21，培养一段时间。挑取单菌落接种到5mlLB液体中，37℃震荡培养过夜。将过夜培养物按1%转接至新鲜20mlLB液体，37℃，220rmp震荡2-2.5h。

2．取2个干净的Ep管（编号SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp离心5min，弃上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp离心5min，弃上清。

3. 利用残留液体涡旋细胞，然后加入800μl预冷的0.1M CaCl2，冰浴悬浮细胞，随后4000rmp离心5min，弃上清。

4. 加入100μl冷0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，冰浴20min，之后分装于管中

2.6.2pET28a-EGFP重组质粒的转化、鉴定

表6.质粒转化

    除此之外，还可对挑取的单菌落做菌落 PCR 检验, PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后,若发现在约750 bp 处有清晰条带，则与理论相符, 可以初步确定为阳性克隆。进一步对阳性菌落中的质粒进行提纯、用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ对质粒进行双酶切, 经1. 0%琼脂糖凝胶电泳判断。还可以直接将 PCR 产物进行测序, 通过与 GenBank 序列比对,可以证明目的片段  EGFP 是否已正确连接到 pET28a 表达载体。

参考文献：

1.季爱加, 宁喜斌  原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表达  微生物学杂志  2011 年7 月第31 卷 第4 期

2.张丽琼  抗菌肽DCD_1L与增强型绿色荧_省略_菌Transetta中的融合表达

3.辛国志 王玉英 卢波 王代红  蛋白质的分离提纯及鉴定分析方法  中国环境卫生  2005年第8卷第1期

4.刘默芳 王恩多  绿色荧光蛋白  生物化学与生物物理进展 2000：27（3）