第三代测序技术的三种技术平台介绍

随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。

最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。

目前，第三代测序主要有三种技术平台。两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。

最近，Oxford Nanopore Technologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。

a-溶血素纳米孔(剖面图)以及共价结合的环式糊精(浅蓝色)瞬间结合落入孔中的碱基(红色)。

以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚硫酸盐转化，而纳米孔技术能直接读出这第五种碱基。这对表观基因组测序的研究人员来说可谓是个好消息。

纳米孔测序预计能满足大部分测序用户的需求：99.8%的准确性相当高，且错误很容易通过计算来纠正。均聚物延伸也没有问题，因为纳米孔记录每一个碱基，而不管其前后的碱基。读长也会很长。Bayley认为：“它有可能读取数千个碱基，序列质量也不会下降。即使中途有一些小差错，它也可以重新开始。”

但是，Oxford Nanopore的测序仪仍面临两个重要的技术问题。一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，让它每次只掉入一个碱基，这是一个大挑战。另一个是并行化。这个问题可能简单一些。他们可以开发出一个芯片，上面有数万个孔，来确保整个测序过程更快速。

在纳米孔测序技术的推动下，实现千元基因组的目标指日可待了。

基因测序技术始于上个世界70年代，到目前为止已经发展到了第三代测序技术。第三代纳米孔测序技术因为其不再需要荧光标记物使测序价格大大降低，这项技术预示着基因测序技术又登上了一个新的台阶。