腺病毒的包装步骤 自己总结 很详细

1、从NCBI网站上查找相应基因（如小鼠KL14基因）的编码区，即CDS序列。

2、根据KLF14 CDS设计相应的引物，PCR来扩增KLF14的编码序列，即KLF14的cDNA

3、将扩增出来的cDNA序列连接到PGEM-Teasy载体，蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌，提质粒，EcoR I 酶切鉴定，然后送测序

4、测序正确后用性内切酶把cDNA切下来连接到pcDNA3.1载体(很重要的一种表达载体)上，做报告基因实验。

5、双荧光报告基因检测其对下游的靶基因启动子有作用以后，用合适（HindIII和XhoI）的性内切酶将连接到pcDNA3.1上的KLF14 cDNA切下来，凝胶回收，同时也切pAdTrack-CMV 回收。把KLF14 cDNA连接到pAdTrack-CMV载体上。

6、在包装腺病毒之前要先用western检测一下连接到pAdTrack-CMV的KLF14的cDNA能否表达出蛋白。把第5步连接好的质粒用转染试剂转染293A细胞，然后收细胞（RAPI裂解液，加蛋白酶抑制剂），提取蛋白，做western，杂标签抗体（Myc或Flag）。只有在293A细胞有表达之后才可以继续包装。

7、在第5步最好多提取一些连接好的KLF14 cDNA-CMV质粒，浓度高点。然后用PmeI酶切，让这个质粒线性化（大概要切10ug左右，50ul的体系）。然后跑胶回收切开的质粒，一般PmeI都可以完全切开，大概要回收3-4ug。

8、将回收的线性化产物加入到BJ5183感受态细菌中（该细菌中已经含有pAdEasy-1质粒），电转化让其发生重组。然后在kanamycin抗性的平板上筛选，就按一般的热激，涂板的方法转化就可以。因为重组后的pAdTrack-CMV-KLF9+ pAdEasy-1非常大，大约41.5kb，所以要差不多在37度细菌孵箱中生长16-20h才可以，即使长出菌落，也是非常小的那种。非常大的菌落肯定不是重组上的。

在kanamycin抗性平板上筛选，是因为pAdTrack-CMV质粒上有Kan抗性，而pAdEasy-1则没有任何抗性。理论上讲只有重组上的质粒才有可能在有Kan抗性的平板上长出菌落。

9、挑取小菌落，提取质粒，然后用PacI酶切，鉴定是不是重组的质粒。

酶切鉴定时要设置两个对照，一个pAdTrack-CMV-KLF9（约11kb），另一个是pAdEasy-1（约34.4kb），重组质粒大约41.5kb。将这三个质粒都用PacI酶切。

1pAdTrack-CMV-KLF9含有两个PacI酶切位点，会切出3kb和8kb两条带

2pAdEasy-1只含有一个PacI酶切位点，跑胶时只会有一条比较大的带34.4kb

3重组的质粒也有2个PacI酶切位点，切开后会有两条带，一条和①中的一样3kb左右，另一条则是非常大的一条带，比②中的条带还大，或者差不多大

10、鉴定正确以后，将从BJ5183菌株中提取的质粒，转化到DH5a感受态中大量扩增。然后提取质粒，浓度也不会太高。（电转以后的BJ5183菌株不能保存菌种的）。

将提取的重组质粒用PacI切，让它线性化，一般要切10ug，50ug体系37度酶切8h以上。然后加3倍体积的无水乙醇-80℃沉淀过夜。之后12000rpm，4℃，离心15min，弃去上清液，再用75%的乙醇清洗一次，晾干后用ddH2O溶解，不要加水太多，然后测回收的浓度。

11、把回收到的线性化重组质粒用lipo2000转染293A细胞(脂质体的转染效率强)，转染的时候液体都要用无血清的DMEM培养基，转染完6h以后换液。转染的时候293A状态要很好，密度在百分之七八十。（用细胞培养瓶，不能用培养皿）

转染之后的3-4天不要动，之后每天可以观察一次有没有出现绿的噬菌斑，在此期间不能换液，只能一点一点的补加DMEM，直到细胞变的全部绿，有50 %左右漂。

12、等到细胞全绿以后，把培养瓶的细胞冲匀，离心，这是第一轮的病毒，利心丸的上清也要好好保留，细胞沉淀用PBS溶，然后液氮反复冻融3次，让病毒释放。用第一轮裂解的病毒上清感染293A得到第2轮的病毒。