热原和细菌内毒素的区别

一、热原(progon)  

医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。  

为提高药品质量和用药安全，人们对热原进行了广泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔检测热原的方法。在1942年美国药典首先将家兔热原检查项收入药典成为法定方法，中国药典1953年版开始收载该方法，随后的世界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的方法之一。  

家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。  

但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。其缺点：  

①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。  

②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。  

③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。  

④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要几百元/次，而鲎试剂仅几十元/次。  

综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大。  

什么是热原？目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素的脂多糖。  

欧洲药典委员会副J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。  

二、细菌内毒素（Endotoxin）  

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1)  

<一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。 

<二>核心多糖：核心多糖的变异性较小，位于类脂A和0—特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。 

<三>类脂A：位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（10—18C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。 

由于类脂A有4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素LPS是极为不稳定的。这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。  

三、内毒素的生物活性与疾病的相关性  

据文献报道，在很早期（约19世纪末）的意大利学者Centanne通过菌属自溶的方法，从革兰氏阴性杆菌中提取出一种类似毒素的物质，因为这种物质对动物体产生致热活性的同时，亦产生出一种病理学病性反应，而被命名为致热毒素（Pyrotoxina）。同时由德国的Buchner也从多种细菌中提取到相似的致热毒素，并证实了这种毒素在导致白细胞数目的改变同时，具有增强机体对细菌感染时的免疫能力。因此建立了“发热疗法”。  

在美国纽约的临床医师，William B•Coley用加热法杀死录杆菌和化脓性链球菌，将上清滤液用于各种恶性肿瘤（特别是肉瘤）的治疗，取得较好的疗效。他将这种细菌上清液命名为Coley氏毒素。此后murrayJ.Shear 证实Coley氏毒素中具有抗肿瘤作用的物质为内毒素。  

直到1933年Boivin等学者在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时，从鼠伤寒杆菌中提取出内毒素。在50年代以后，对内毒素的化学成分和化学结构的研究得到迅速发展。经过大量实验表明，内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发生内毒素休克和死亡。  

内毒素的致病机理，主要是由于革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌、沙门氏杆菌、伤寒杆菌，布氏杆菌、变形杆菌金黄色葡萄球菌等）和其它微生物（病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等）感染时，这类菌属随病灶渗液进入血液循环，并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖，这类菌属在体内死亡和解体后，才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖（LPS），据初步实验表明，当机体内毒素浓度國值 > 0.005ng/ml时,可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和β2—干扰素等。这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热，细菌内毒素直接或间接作用于肝脏和胰腺时，可使肝细胞损伤，使糖原异生酶（如葡萄糖—6—6磷酸酶、糖原合成酶）的活性降低，抑制糖原的异生和分解。同时内毒素作用于胰腺导致胰腺功能障碍，并形成胰岛素抵抗，造成血糖升高致使并发心肌炎和心肌肿大的系列高血糖症状。所以，革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进入体液细胞繁殖，当其死亡或解体后产生的内毒素，可多次进入血液，引起反复发作，其病理变化极为广泛，几乎所有的器官和组织都可被侵犯，而引起各器官的功能障碍。其中以网状内皮系统最常见，淋巴、脾、肝、肾、骨髓中均有上皮细胞增生，形成肉芽肿，以肝脏有肉芽肿外，还可发生冲血、水肿和肝细胞坏死，最终导致肝硬化的发生。其它器官亦有相似的毒性反应。

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。 热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用也越强。  

注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称为“热原反应”。  

热原没有多少这一概念， 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。  

1、热原检查法  

由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。  

2．细菌内毒素检查法  

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。  

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。  

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法

一 热原（pyrogen）是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。 

　　一、热原的性质及除去热原的方法 

　　1.高温法 

　　热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 

　　2.吸附法 

　　热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。 

　　3.超滤法 

　　热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。 

　　4.蒸馏法 

　　热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。 

　　5.酸碱法 

　　热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。 

　　6.其它 

　　包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。 

　　二、热原的检查方法 

　　《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。 

　　1.热原检查法 

　　由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 

　　《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的 限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结 果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。 

　　2.细菌内毒素检查法 

　　细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（eu）表示。 

　　细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。 

　　鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。 

二  细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A 

  细菌内毒素这个概念在10年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 

    细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见上图表 

  细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10%左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。  

（1）脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。  

（2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。 

（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。 

    细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。 

    一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物与微量)细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术.因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点,自从一九***年美国学者Levin 和 Bang发现此法以来[1],鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中.     鲎法大致可分为凝胶法、比浊法色原基质法、以及免疫法等.本文依据文献报道,总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展,以供试验者参考.   1 试验条件与操作 培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]. 1.  1 时间 鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度,故加样结束后,应立即放入恒温水浴中. [3]延长保温时间,可提高LAL的灵敏度.[4]     有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律,即５分钟时混合点的活性最强,混合时间越长,活性反而降低,但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内.     在显色法中灵敏度与时间有关,故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间,又要严格控制终止时间[2][6][7]. 1．2 温度 凝胶试验规定的孵化温度为37℃.但在夏季高温季节,如果同时作几个样,阳性对照不成立的现象时有发生,故应改为冰浴.[3] 郭录平[4]通过实验证明,保温在25-41℃内,随着温度的升高,LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间,对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂.     另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]. 1.3 pH值     高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响,结果发现:样品 pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时,实验受到抑制,平均回收率≤56.8%.最后得出结论:使用TAL 时,供试品 pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用 LAL 时,pH 应预调在6.2±0.1或 6.7-7.8为好. 也有人认为[4][7][9] 鲎试验的 pH 应为6.5-8.5,以7.0-7.5为佳.必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 调节 pH 值[2]. 1．4 试验器具     内毒素稀释不宜用注射器,而应用经过校正的刻度吸管.因为注射器刻度不准,而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]. 普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9],用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适.一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低,管对测定的结果影 响愈大.操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果. 1．5 操作程序 有实验者发现[3][11]:操作次序也影响试验结果.应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液,最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂.未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象. 1.6 处理作用  Pedersen MR和Hansen EW[12] 将内毒素溶液用玻璃试管干燥,在氧丙环(Ethylene Oxide,EO)450或900mg/l中暴露1-46小时后,内毒素的LAL活性减少至百分之三十.将多粘菌素B(Polymyxin B,PB)加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五.内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十,进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九.EO对内毒素的反应会减少其LAL活性,也会减少其热源反应,增加与PB的亲和性.      Bamba T[13] 等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素(Smooth gram-negative bacteria ,S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果,观察到不同种细菌的抗热性显著地不同,减弱率与浓度有关.低浓度(10ng/ml)内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下.粗糙型(Rough strains,R-form) 细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似.平滑型,尤其是Rc突变体(Rc mutant)细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+,Ca2+等二价阳离子显著影响.     FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差.Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题.然而,因为溶液在瓶中没有充分震荡,溶剂与橡胶塞接触,约有百分之二十到四十的内毒素丢失.解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中,并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤. 姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现,溶解后的细菌内毒素应用液(0.5-1.0Eu/ml)在0-4 ℃ 放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱,可冷冻保藏20天,但反复冻融活性会逐渐降低. 2 供试品 2.1 多糖[2] 我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性,而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖(1-3-β-D-葡聚糖)(curdlan,1-3-beta-D-glucan)也会使常规的内毒素实验呈阳性,因为LAL中含G因子[16]. 据报道[17][18],能激活鲎试剂旁路(G 途径)的物质主要是(1-3)-β-D-葡聚糖(包括(1-4)-β-D-葡聚糖和(1-6)-β-D-葡聚糖)以及LAL-RM(LAL-Reaction Material)两类,如真菌多糖(Fugal polysaccharide)、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪(人工肾,血液透析仪)洗涤液等.实验室常用的酒精,棉球等也含有较多的(1-3)-β-D-葡聚糖.低于一定浓度的(1-3)-β-D-葡聚糖或LAL-RM不 足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果,但如果有细菌内毒素共同作用的情况下,凝集反应会变得更为激烈和迅速,很容易使反应出现阳性结果.我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液(Antienhancement Solution). Cooper JF 和 Weary ME[19] 等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异,所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾.动态LAL方法(Kinetic LAL methods)对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用.葡聚糖在非口服制剂中不常见,只限于被微生物或纤维素物质污染的产品.并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法. 另外,丹麦科学家[20]发现,细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B (dimethyl sulfoxide and polymyxin B)合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体(monoclonal antibody against Limulus factor C)所抑制.他们还发现β-葡聚糖(beta-glucan)激活途径能完全被昆布糖(laminarin)所阻碍,而不影响内毒素的激活途径.人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的,而非内毒素途径.     八十年代后,日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂,如:Endospecy,以及只与(1-3)-β-葡聚糖反应的鲎试剂:SLP试剂及Gluspecy.[21] 2.2蛋白 2.2.1阳离子蛋白     几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白(Cationic proteins)如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G (lysozyme, ribonuclease A, and human IgG)能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体,对细菌内毒素有显著的屏蔽作用,从而影响用鲎法来测定细菌内毒素.试验证明,苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理(phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment)等方法都不能够解除此作用.胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶(trypsin, chymotrypsin, or pronase)等只能回收10%-20%的内毒素,然而如在测定之前,用蛋白酶 K (proteinase K)来消化样品,可使细菌内毒素的回收率达到百分之百.进一步研究还发现,多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺(poly-L-lysine and poly ethyleneimine)作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去,从而有利于进一步的测定. 2.2.2 血蛋白 Roth R与IKaca W 证明[23][24],血红蛋白能与LPS结合,这种结合会改变LPS的一些物理特性,从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用.     据报道[2][17][18]:人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子.有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致. 2.2.3 免疫蛋白      Baek L[25] 等人通过免疫电泳方法表明,假单孢绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞膜的一些可溶性抗原(Soluble antigens)与LAL能够反应. 有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5( mouse monoclonal IgM antibody E5)来测定其抗不同菌种LPS的活性.结果证明,由于细菌种类不同,经E5处理后,LPS活性减弱的程度也不同,一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性. 另据报道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途径. 2.3 离子     离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9],因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集,加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子. Guyomard S; Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素,即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌(Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and  Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性.发现添加Mg2+增强了LAL显色反应(160mmol/l最佳),而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应,0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应.由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱(160mmol/l).当在反应的第一步(细菌内毒素与LAL孵育)时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应,而在反应的第二步,即加入生色底物(chromogenic substrate)时这些阳离子则不会改变LAL生色反应.     据报道[7]当鲎血被抽出后,用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集,即使有内毒素存在也不凝聚,但当有钙或镁离子存在时则很快凝固,由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用,但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成.因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时,Ca2+,Mg2+离子将失去作用[2][9],从而影响本法的测定. 有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时,证明钍与铁对内毒素的活性有强烈的影响,但由于其在鲎血中的含量甚微,故并不干扰实际测定.[7] 生理盐水中的 NaCl 对显色反应有干扰[28],但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水. 相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子,使实验呈假阴性,可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液,或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰.[29] 2.4 有机盐 核酸钠(Sodium Nucleinate,NN)像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测,有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果. 2.5 透析液     Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料.透析液中的G-小分子热源物质能够透过正常的透析膜.纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素.聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素.所以,鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质.     Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜,尽管在血液中没有测到LAL反应物质,所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分. 日本学者 Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素,而是通过另一种途径使LAL凝集,此物质在循环中滞留相当长的时间.并发现在急性及慢性血液透析中,此反应物质平均水平为100-400pg/ml. 仲卫华[34]等的实验证明,血液透析液有一定的干扰作用,但可通过稀释法消除. 以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察. 2.6 中药成分[21]     许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35],特别是清热解毒类药物[29]. 2.7 生化药品[21]    姜素云[2][36]等证明,氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用.    孔祥文[28]通过实验证明,基因工程蛋白类药物生产中常用的 2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用,当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除. 2.8 其它物质 另据报道[2][9][21][29]:人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质(乙醇、苯酚)或灭活的物质(如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等)、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等,都可干扰鲎试剂形成凝胶.  

3鲎试剂与标准品  3．1 鲎试剂内源性因子  Roth RI与Tobias PS[37]在 研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份(chromatographic fraction of Limulus lysate)时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记(photoreactive, cleavable, radiolabeled)的沙门氏菌LPS衍生物(derivative of Salmonella minnesota LPS),LPS-(P-叠氮水杨酰胺)-1,3-二硫丙胺(LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ,LPS-ASD),来确定LPS-结合蛋白.结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白,充当凝集反应的负调节因子,LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物. 日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹(horseshoe crab (Tachypleus tridentatus))血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物(Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor,LICI)1型、2型、及3型.LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶(limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease),C因子(K1=2.5×106 M-1,S-1)；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶(limulus clotting enzyme)(K1=4.3×105 M-1,S-1)；LICI-3强烈抑制对(1,3)-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶((1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease),G因子(K1=3.9×105 M-1,S-1).因此,鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节:LICI-1 是Mr=48,000,有394个氨基酸的单链糖蛋白,其单一反应位点为-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42,000,有386个氨基酸的单链糖蛋白,其单一反应位点为-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53,000,有392个氨基酸的单链糖蛋白,其单一反应位点与LICI-1相同.  3．2 试剂质量     不同批号的鲎试剂标示值相同,但试验结果不尽相同,尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势.所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候,应对灵敏度进行复核.以确定本批鲎试剂的实际灵敏度.[3] 有的同志发现[11]:使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂,结果会导致假阳性的出现,而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定. 另外,还有试验者发现[41][42][43]:不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下.支与支之间差异竟达50%.[10] 高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量.这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]. 参考文献: 1  Levin,J,and Bang, F. B.  Bull Johns Hopkins Hosps. 265-274(19) 2      陈菡芬 申蕴如 内毒素检查方法研究进展 国外医学药学分册 1992.19(5) 3       陈雪梅  用鲎法检查内毒素阳性对照反应不成立时的浅见 中国药检药理工作通讯 1990；2(2) 4       郭录平 浅谈影响鲎试验的因素 中国药学杂志 1996.31(3) 5 苑庆华 孙淑莲 叶志 细菌内毒素标准品溶解时不同混合时间对其活性的影响研究  第三届中日药品分析技术研讨会论文摘要集 1996.10 6       刘敏等 显色基质法测定输液中内毒素含量 中国药事 1996.10(6) 7       李菊芬  鲎试剂对热源的检测及有关研究的进展 中国药检药理工作通讯  1991,3(2) 8 高国政 颜锦 pH 值影响细菌内毒素测定的实验研究 中国药学杂志 1998,33(3) 9       James F.Cooper  Resolving LAL Testing Interferences  J Parent sci Tech 1991 44(1) 13-15 10    侯庆源 鲎试验系统工程化 中国医院药学杂志 1997.17(1) 11 姜锦发 用鲎法检查细菌内毒素时影响实验结果因素的探讨  中国药检药理工作通讯  1995,7(1) 12  Pedersen MR; Hansen EW  Inactivation of B. subtilis spores and E. coli endotoxin by ethylene oxide.  J Clin Pharm Ther 19 Oct;14(5):373-80 13  Bamba T; Matsui R; Watabe K  Effect of steam-heat treatment with/without divalent cations on the inactivation of lipopolysaccharides from several bacterial species.  PDA J Pharm Sci Technol 1996 Mar-Apr;50(2):129-35 14  Guilfoyle DE; Yager JF; Carito SL   The effect of refrigeration and mixing on detection of endotoxin in parenteral drugs using the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test.  J Parenter Sci Technol 19 Jul-Aug;43(4):183-7 15 姜素云 时继慧 细菌内毒素的稳定性考察 中国药检药理工作通讯 1991.3(1) 16  Miyazaki T, Kohno S, Mitsutake K, Maesaki S, Yamada H, Yasuoka A, Sasayama K, Kaku M, Koga H, Hara K  Limulus test (factor G) and polysaccharides from fungus  Kansenshogaku Zasshi 1992 Aug 66:8 1030-6 17    郭建芳 夏振民 论鲎试验的假阳性 中国药事 1996.10(3) 18    夏振民 刘大英 特异鲎试剂的进展 药物分析杂志 1997.(17)5 19  Cooper JF; Weary ME; Jordan FT  The impact of non-endotoxin LAL-reactive materials on Limulus amebocyte lysate analyses.  PDA J Pharm Sci Technol 1997 Jan-Feb;51(1):2-6 20  Zhang GH, Baek L, Buchardt O, Koch C  Differential blocking of coagulation-activating pathways of Limulus amebocyte lysate.  J Clin Microbiol 1994 Jun 32:6 1537-41 21 苑庆华 唐元泰 细菌内毒素与鲎试验法 中国药检药理工作通讯  1997,8(1) 22  Petsch D; Deckwer WD; Anspach FB  Proteinase K digestion of proteins improves detection of bacterial endotoxins by the Limulus amebocyte lysate assay: application for endotoxin removal from cationic proteins.  Anal Biochem 1998 May 15;259(1):42-7 23  Roth RI; Kaca W  Toxicity of hemoglobin solutions: hemoglobin is a lipopolysaccharide (LPS) binding protein which enhances LPS biological activity. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 1994;22(3):387-98 24 Roth RI; Kaca W; Levin J  Hemoglobin: a newly recognized binding protein for bacterial endotoxins (LPS).  Prog Clin Biol Res 1994;388:161-72 25    Baek L; Hoiby N; Hertz JB; Espersen F  Interaction between limulus amoebocyte lysate and soluble antigens from Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus studied by quantitative immunoelectrophoresis.  J Clin Microbiol 1985 Aug;22(2):229-37 26  Kobayashi H, Oishi S, Koumoto A, Yoshida T, Matsunaga T, Ogawa M  The inhibitory effect of mouse monoclonal IgM antibody E5 against endotoxin on limulus activity of various lipopolysaccharides  Kansenshogaku Zasshi 1994 Mar 68:3 314-8 27 Guyomard S; Darbord JC  Quantitative determination of bacterial endotoxins by the chromogenic limulus method: critical analysis and study of interactions between 3 divalent cations Ann Inst Pasteur Microbiol 1985 Jul-Aug;136B(1):49-55 28    孔祥文 邱文 定量鲎试验法检测细菌内毒素的几种干扰因子 中国生化药物杂志 1998.19(1) 29    陈桑雅 细菌内毒素检查法在药品检验中的应用 现代应用药学 1997.14(3) 30  Dressel H  The effects and properties of sodium nucleinate as a pyrogen working- standard. 9. Pyrogen detection with epinephrine-skin-, dactinomycin- and LAL-tests. The suitability of sodium nucleinate as a pyrogen standard  Pharmazie 1991 Oct;46(10):712-5 31 Be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细菌内毒素分析仪（BET-24A）由欣嵘科技有限公司全国总代理。该仪器填补了国内检验领域的一项空白。BET-24A细菌内毒素分析仪，是用于临床快速定量检测细菌内毒素含量，早期诊断病人的细菌感染情况，尤其是对准确判断因内毒素感染导致的多脏衰（MODS），全身炎性反应，脓毒症及各种因感染而引发的疾病，提供准确的检测诊断数据。该产品已经正式用于临床内毒素定量检测，国家药监局提出即日起在全国5000多家医院开始推广应用。 

● BET-24A产品简介 

　　内毒素系存在于革兰阴性菌细胞壁外膜中的一种相对不溶性物质，它的主要成分是脂多糖( LPS )，能够引起发热、休克、器官损害、甚至死亡等病理反应。 

细菌内毒素分析仪采用先进的光密度反应时间法测定原理，配有目前最先进的专利技术鲎试剂安瓿直接检测，操作简便，检测时间短，能准确检测出人体内毒素的含量，从而为临床内毒素血症的早期诊断，及指导临床及时合理用药具有重要价值。 

● BET-24A产品特点 

1、 灵敏度高。一般正常人体内细菌内毒素含量为0~0.1EU/ml,使用BET-24A能精确测量出最低限量内毒素为0.001EU/ml，具有相当高的灵敏度。 

2、 检测时间短。仅需1个小时就能检测出供试品的内毒素含量，直接判断并可接受24个供试品的同时检测，随插随用。 

3、 多渠道采样，方便快捷。可通过血液、腹水、脑脊液、尿液等体液采样，经简单处理后可直接检测内毒素指标。 

4、 专利技术，检测方便。直接用鲎试剂安瓿检测，随时插入样品检测。 

5、稳定性高，抗干扰能力强。使用660nm检测波长，优化的血液前处理过程，避免了血液中其他物质的干扰。 

● BET-24A临床应用价值 

1、临床诊断价值： 主要用于ICU，血液科，烧伤科，感染科，呼吸科，消化科等相关科室，为广大临床医生提供新的诊断依据。 

2、临床科研价值： 为广大内毒素研究人员、临床工作者深入研究内毒素与临床关系，提供方便准确的检测工具，有利于更多临床内毒素领域研究成果的涌现。 

● BET-24A临床内毒素检测意义 

        早期判断革兰阴性细菌感染情况。 

        相关疾病的早期诊断与病情监控。 

        帮助临床医生筛选适当的药物。 

        评价临床治疗及预后情况，提高临床治愈率，降低死亡率。 

● BET-24A市场营销方案 

1、营销渠道构建和管理 

实行区域代理制，充分利用区域经销商现有网络和各方面资源，逐步建立一级、二级多层分销网络，加强对经销商的考核管理、促销激励落实、市场走访工作，规范网络价格体系和销售行为，加强全国性的宣传推广，建立全方位技术支持服务体系，完善的售后服务体系，与经销商共同成长、实现双赢。 

2、全方位学术支持、技术服务和品牌建设 

1）各省产品注册备案、物价备案、各招标地区投标的及时服务 

2）BET-24A产品网站和企业网站全方位宣传和在线沟通 

3）在各医药类、临床类杂志期刊发表相关学术论文。 

4）建立临床内毒素专家库，积极参加各地学术会议，提升产品知名度 

5）建立咨询热线、提供技术服务、组织产品培训 

● BET-24A市场营销目标 

BET-24A填补了国内临床内毒素检验的一项空白，我们计划三年内产品覆盖所有国内大中型城市三级医院；五年内产品覆盖所有二级包括二级以上医院；用3~5年的时间“打造临床内毒素定量检测第一品牌”。 

● 售后服务 

公司将对代理商实行区域销售，严格保护，禁止一切形式的串货行为。由专业人员对代理商进行产品知识培训，并对其用户做仪器操作指导。及时提供相关证件、资料，保证按时发货、返利（详细情况见代理协议）。同时公司将赞助参加部分相关学术会议，建立专家库，汇编中外专家撰写的论文，为您大力提供学术支持