转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法

转氨酶（谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的测定：（2.5g样）（参考吴良欢等的《植物转氨酶（GOT和GPT）活度比色测定方法及其应用》）

O.05mol/L Trs—HCL缓冲液(pH7．2)：0.2mol／L 三羟甲基氨基甲烷(30.25g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200m1)200ml和0.2mol/L HC1 221ml，用蒸馏水稀释至1000ml。

0．1mol／L磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g，磷酸二氢钾(AR)2.176g，加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。

2，4一二硝基苯肼溶液：称取2，4一二硝基苯肼0.099g，用10mo/L HCl 50ml溶解后，加蒸馏水至500rnl，保存于棕色瓶中备用，此液可保存3个月。

0.4mol／L氢氧化钠溶液：32g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至2L。

lmol／L氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至250ml。

丙酮酸标准液(2 µmol／m1)：精确称取纯丙酮酸钠0.022g 于100ml容量瓶中，加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。

GOT底物液(DL一门冬氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL一门冬氨酸6.65g置于一小烧杯中，加入lmol／L氢氧化钠51.25ml使溶解，并校正pH至7.4，然后将溶液移入250ml容量瓶内，用0.1mol／L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。

GPT底物液：(DL一丙氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL--丙氨酸4.475g置于一小烧杯中，加入0.1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约200ml煮沸溶解后，待冷，用lmol／L氢氧化钠调pH至7．4(约加1.25m1)，再加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至25Oml混匀，加氯仿数滴防腐，贮于冰箱内。

粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称2.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0．05mol／LTris—HC1缓冲液（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1 谷草转氨酶(GOT)的测定：

0.1ml粗酶液 ＋ GOT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，60min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。

工作曲线绘制：取lOml试管5支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GOT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

2 谷丙转氨酶(GPT)的测定：

0.1ml粗酶液 ＋ GPT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，30min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GPT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。

工作曲线绘制：取lOml试管6支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GPT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30、0.25 ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

结果计算

转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(µmol)表示。

GOT活度，µmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)

GPT活度，µmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)

式中，C一丙酮酸标准溶液的浓度(µmol／m1)；V一由工作曲线查得的丙酮酸体积(m1)；2O一稀释倍数；2一反应时间换算系数，GOT实际反应时间为1h，按习惯本法酶活性以30min计算，故应除以2；m一植物鲜重(g)。

3 谷酰胺合成酶（GS）的测定：

方法1：

O.25mol／L 咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)：

O.30mol／L 谷氨酸钠溶液(pH7.O)：

30mmol／L ATP—Na溶液(pH7.O)：

O.5mol／L MgS04溶液：

羟胺试剂：

FeCl3溶液：

测定酶活性反应液组成如下：0.6ml咪唑-盐酸缓冲液(O．25mol／L，pH7.0),0.4ml谷氨酸钠溶液(O.30mol／L，pH7.O)，0.4ml ATP—Na溶液(30mmol／L，pH7.O)，0.2ml MgS04溶液(O.5mol／L)，酶粗液1.2ml。反应液在25℃水浴中保温5 min后，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应，15 min后立即加入0.8 ml酸性FeCl3试剂终止反应。混合液在4000 r／min离心15 min，测定上清液在540nm处的光密度。一个GS活性单位定义为该反应条件下，在15min反应时间内催化形成1µmol r-谷氨酰异羟肟酸需要的酶量，总活性为：每克鲜样酶粗液在15min的反应时间内催化形成r-谷氨酰异羟肟酸的µmol数。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）

方法2：

酶活性反应液组成为：0.6 ml咪唑-盐酸缓冲液，0.4 ml谷氨酸钠溶液，0.4 ml ATP-Na溶液(30 mmol/L，pH 7．0)，MgSO4溶液(0.5 mol/L )，酶提取液1.2 ml。反应液0.2 ml在25℃水浴中保温 5 min，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应。在25℃水浴中反应15min，加入0.8 ml反应终止液。混合液在4000×g离心15 min，在540 nm处测定上清液的光密度。一个GS活性单位定义为在该反应条件下，15 min反应时间内每克鲜重光密度的数值。（参考马新明，李琳，赵鹏，熊淑萍，郭飞的《土壤水分对强筋小麦‘豫麦34’氮素同化酶活性和籽粒品质的影响》）

方法3：（参考赵志杰，史，董新纯编的《植物生理学实验指导》）

方法4：依次取lml 咪唑-盐酸缓冲液、0．5mol／L MgCl·6H20、50mmol／L EDTA—Na 、lmol／L Glu—Na 、0．498mmol／L盐酸羟胺各0．2mL放入试管中，在迅速加入lmL粗酶液混匀，于30cC水浴上反应15min，然后立即取出，加入lmL终止显色液(0.37mol／L FeC1 、0.67mol／L三氯乙酸、0.2moL／L HC1)终止反应，在5000r／min下离心10min，取上清液测540nm处消光值，对照在加完所有反应液后，先加入lmL终止显色液，再加入lmL粗酶液，对照管的其余步骤与测试管相同。对照标准曲线求出r-谷氨酰胺基羟肟酸的生成量，计算酶的活性。（参考赵越，魏自民，马凤鸣的《不同水平铵态氮对甜菜还原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影响》）

4 谷氨酸合酶（GOGAT）的测定：

反应混合液包括0.4ml 20mmol／L的 L-谷氨酰胺，0.5ml 20mmol／L的a一酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，总体积3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCI缓冲液(pH7.6)补足(1．5m1)。反应启动后，用752紫外可见分光光度计于340nm处每30s测定1个消光值，连续测定11次，取光密度稳定减小的一段来衡量酶活性。一个GOGAT活性单位定义为在该反应条件下，每分钟反应混合液减少1µmolNADH为一个酶活性单位。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）

5 谷氨酸脱氢酶(GDH) 的测定：

提取液：0.2 mmol／L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液。

反应液A：1.6µmol／L NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。

反应液B：60µmol／L L一谷氨酸 + 1.6µmol／I NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。

1 mL酶提取液+2 mL反应液B，以加反应液A为对照于340 nm处比色，每隔30s记录一次0D值，直至读数稳定。（参考张智猛，张威，胡文广，矫岩林，王磊，李伟芳的《高产花生氮素代谢相关酶活性变化的研究》）

6 氮含量的测定：（2.5g）

样品提取液的提取:称取新鲜植物组织2g，加入15ml无离子水研磨成匀浆，置于45℃振荡机中摇动浸提lh后用5ml无离子水冲洗干净，然后离心或过滤(如含色素需用活性炭脱色)，滤液备用。

6.1硝态氮的测定：

标准氮试剂：精称KNO3 0.9021g，溶于少量重蒸无离子水中，并定容至250ml，含N 量为500µgNO3一N／ml。

5％水杨酸一硫酸溶液：称取水杨酸5g，溶于100ml浓H2SO4(比重1．84)中，搅拌溶解后贮于棕色瓶内，冰箱中至多保存l周，最好现用现配。

 2mol／L NaOH溶液：称取NaOH 80g放入500ml硬质烧杯中，加入重蒸无离子水200ml，溶解后定容至l000ml。

操作方法

标准曲线制作取：50ml容量瓶6只(编号)，依次加入标准氮试剂5、l0、l5、20、25、30ml，用无离子水定容，则成为50、100、l50、200、250、300 ug／ml的氮系列标准溶液；再取干沽50ml三角瓶7只，分别装入上述系列溶液0．2ml，剩下的1只三角瓶加入无离水0.2ml(作为O 点)；然后分别加入5％水杨酸一硫酸溶液0.8ml，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液l9ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；并以OD 值为纵座标，以标准氮(0、50、l00、150、200、250、300 ug)为横座标，绘制一条标准曲线(通过原点的直线)。

0.1ml滤液＋0.4ml 5％水杨酸一硫酸溶液，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液9.5ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；结果计算

按照公式A= CV1/(WV2) 计算。

式中：A—NO3一N含量(ug／g)；W一样品重(g)；V1一样品提取液总量(m1)：V2一样品反应液数量(m1)；C一样品在标准曲线上查得的N量(ug)：

6.2亚硝态氮的测定：

NaN02 标准溶液：精称分析纯NaNO2 0.243g，以无离子水溶解并定容至50ml,再吸取此溶液5ml定容至l000ml，作为母液，其浓度为5µgNO2一N／ml。

磺胺试剂：称取分析纯磺胺(或对氨基苯磺酸)l0g，加浓HCI 250ml(需用水浴加热溶解)，用无离子水定容至lL。

ɑ一萘胺试剂：称取分析纯ɑ一萘胺2g，加浓HCI 250ml，溶解后定容至1L。

操作方法

标准曲线绘制：取干沽试管6支(0～5号)，依次加入标准NaNO2母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，再依次加入无离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml：摇匀后再在各管分别加入磺胺试剂和ɑ一萘胺试剂各2ml：摇匀后于35"(2水浴中显色30min，于520ml处比色，绘制出标准曲线。

lml样品提取液＋2ml磺胺试剂＋2mlɑ一萘胺试剂，摇匀后于35℃水浴中显色30min，于520ml处比色。

结果计算

按照公式A= CV/W计算。

式中：A— N02一N 含量(µg/g)：

C一查标准曲线值(µg)；

v一样品提取液总量(ml)；

W一样品重(g)

6.3 氨态氮的测定：

10%醋酸：100ml醋酸＋ 900ml无离子水。

0.2mol/L pH 5.4醋酸缓冲液:2.5465ml醋酸＋1.678g醋酸钠，定容到250ml。

水合茚薀三酮试剂：12g茚薀三酮 ＋ 150ml正丙醇溶解后＋300ml正丁醇＋600ml乙二醇，混匀，加入90ml 0.2mol/L pH 5.4醋酸缓冲液后混匀，于阴凉处保存在棕色瓶中（10天内有效）。

1%抗坏血酸：1g抗坏血酸＋ 99ml无离子水。

5µg/ml 丙氨酸：0.1g丙氨酸定容到1L，吸取其中的10ml再定容到1L。

标准曲线的制作：

测样：2ml提取液＋3ml水合茚薀三酮试剂＋0.1ml1%抗坏血酸，混匀，盖塞，沸水浴加热15min，取出搅拌冷却，比色OD580。