慢病毒包装操作说明

Protocol No.  PT5135-1

慢病毒包装操作说明

A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物

为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。

所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-X Vectors，Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T细胞。用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。

所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。

1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞，添加10ml的生长培养基。在37℃，5%CO2℃条件下过夜。在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。

2.充分混均Xfect Polymer。

3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂

Tube 1(Plasmid DNA)                             Tube 2(Polymer)

557µl Xfect Reaction Buffer                     592.5µl Xfect Reaction Buffer

36µl  Lenti-X HTX Packaging Mix                 7.5µl  Xfect Polymer

7µl   Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)                 

600µl 总量                                      600µl 总量

注意：Xfect Polymer 不要在室温下搁置长于30min

4.充分混均每个管

5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。

6.在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min，这时可形成纳米复合物。

7.把1200µl的DNA-Xfect溶液（第5步制备）加入到第1步准备好的细胞中，前后左右轻轻晃动培养血，使其均匀。

8.在37℃条件下培养。

9.4小时或过夜后，换10ml的完全生长培养基，在37℃条件下在培养24-48h。病毒滴定量在48h后可达到最高。注意：移弃的培养液包含了可感染的慢病毒。

10.吸取慢病毒悬液。在500g下离心10min。注意：悬浮液包含可感染的慢病毒。

11.用Lenti-X GoStixTM鉴定病毒产物或者滴定病毒株。然后可用病毒产物转导靶细胞。也可在-80℃保存。

B：Lenti-Viruses转导靶细胞

1.转导前12-18h，用完全生长培养基培养靶细胞

2.轻轻混合冻融的病毒株或从细胞包装得到的病毒株，不要涡旋。需要提醒的是每次的冻融都降低2-4倍的病毒效价

3.根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺的添加量。在转导中可用足量的聚凝胺（e.g.4µg/ml ）来获得需要的最终浓度

4.用细胞培养液稀释病毒株，获得需要的MOI。如要不知道病毒效价，可连续稀释病毒株或包装悬液，使得用于转导的病毒总量不会超过病毒包装时培养液的1/3。

5.在靶细胞中加入病毒悬液，转导8-24h。离心的培养液可以增加感染效率。

6.移除丢弃存留病毒的转导培养液，换成新鲜的生长培养液。注意：移弃的培养液包含可感染的慢病毒。

7.继续培养细胞24-48h，在靶细胞中积累基因产物。

8.收集细胞进行分析，或者用合适的抗生素再进行筛选。

注意：为了检测转导效率，可以选取少量细胞用抗生素处理。剩余的细胞可进行后续的分析。细胞进可能用完，但不要转导后少于24h内进行分析。