查尔酮类物质的合成及生物活性研究

The Synthesis and Bioactive Research of Chalcones

巫晓琴 马林*

广州中山大学化学与化学工程学院化学系

摘要 本实验主要研究黄酮类物质中的查尔酮，通过合成及UV、CD测试，研究其对-葡萄糖苷酶和蛋白质非酶糖基化的抑制效果及抑制机理，并总结出初步的构效关系。

关键词 查尔酮 合成 -葡萄糖苷酶 非酶糖基化

1、前言

研究发现以染料木素、槲皮素等为代表的黄酮类化合物是高效的-葡萄糖苷酶非竞争性抑制剂及非酶糖基化抑制剂。我国中医药资源丰富，从传统中药复方中研制-葡萄糖苷酶抑制剂及非酶糖基化抑制剂，必然成为开发防治糖尿病等疾病药物的热点。

查尔酮为黄酮类化合物的一种，其化学结构为1,3-二苯基丙烯酮,以它为母体的天然化合物存在于甘草、红花等植物中,这些天然查尔酮多含酚羟基，如甘草中的异甘草素、红花中的红花苷元等。这些含羟基的查尔酮表现为多种药理作用，如抗肿瘤作用[1]、抗炎作用[2]、镇痛作用[3]、抗溃疡作用[4]、抗病毒作用[5]、抗菌作用[6]、抗真菌作用[7]、抗疟疾作用[8]等。而目前有关其对-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制作用的相关研究开展得较少，鲜有报道。

2、实验

2.1 查尔酮系列化合物的合成

2.1.1 原理

本实验使用含不同取代基的苯乙酮和苯甲醛缩合制备了一系列查尔酮。

2.1.2 仪器与试剂

恒温加热采用巩义市英峪予华仪器厂制造的DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；

熔点在北京泰克仪器有限公司制造的XT-4双目显微熔点测定仪上测定；

IR在德国BRUKER公司Tensor37型傅立叶变换红外光谱仪上测定；

  MS在岛津LCMS-2010A液相色谱质谱联用仪上测定；

核磁在美国 VARIAN 公司生产的Mercury－Plus 300 核磁共振波谱仪上测定。

所用试剂均为市售国产分析纯。

2.1.3 实验方法

2，4-二羟基苯乙酮的合成：

将40g无水氯化锌和10ml乙酸混合均匀后加入4粒分子筛，分批少量缓慢加入11g（0.1mol）研细的间苯二酚，在100℃下回流反应5h。待反应物冷却至室温后倾入120ml碎冰中，产品结晶析出。抽滤，用冰水洗涤两次，得粗品。

查尔酮系列化合物的合成：

4-二甲氨基查尔酮（1）： 苯乙酮2.4g（0.02mol）溶于10ml无水乙醇中，搅拌下加入10% NaOH 20ml，保持反应温度<10℃。逐滴加入3.0g（0.02mol）对二甲氨基苯甲醛的20ml无水乙醇溶液，然后升温至25℃反应。待反应完全后，将反应物倒入冰水中，出现桔黄色沉淀，抽滤，分别用水和无水乙醇洗涤。产率76.3%，熔点108-110℃。MS：m/z=252 (M+1, 100%)。IR：3433cm-1, 1614cm-1。1H NMR：δ=3.04（s, 6H, NMe2）,  6.72（d, 2H, H3, H5）, 7.34（d, 1H, Hα）, 7.47（d, 2H, H2, H6）, 7.54（m, 3H, H3’, H4’, H5’）, 7.79（d, 1H, Hβ）, 8.00（d, 2H, H2’, H6’）。

4-羟基查尔酮（2）： 苯乙酮2.4g（0.02mol）溶于20ml无水乙醇中，将其缓慢滴加入10%的冰冷NaOH溶液中，然后以同样速度滴加2.4g 4-羟基苯甲醛的10ml无水乙醇溶液，升温至25℃搅拌反应。待反应完全后静置，抽滤，用冰冷的无水乙醇洗涤两~三次，产率10%，熔点328℃。MS：m/z=121 ( 100%)。IR：3433cm-1, 1614cm-1。1H NMR：δ=6.92（d, 2H, H3, H5）,  7.26（m, 3H, H3’, H4’, H5’）, 7.50（d, 1H, Hα）, 7.59（d, 1H, Hβ）, 7.98（m, 2H, H2, H6）, 8.20（d, 2H, H2’, H6’）, 9.85（s, 1H, OH）。

3-羟基-4-甲氧基查尔酮（3）： 苯乙酮1.68g（0.014mol）溶于10ml无水乙醇中，搅拌下加入10% NaOH 5ml，保持反应温度<10℃。充分搅拌约20min后，缓慢滴加2.13g（0.014mol）香兰素的10ml无水乙醇溶液，然后升温至25℃反应。待反应完全后，抽滤，滤渣为浅粉色，用冰冷的无水乙醇洗涤两~三次。产率5.1%。MS：m/z=151 ( 100%)。IR：3433cm-1, 1659cm-1。1H NMR：δ=3.74（s, 3H, OCH3）,  6.50~6.51（m, 3H, ArH）, 7.22（d, 1H, CH）, 7.30~7.40（m, 4H, ArH）, 9.27（s, 1H, OH）。

3,4’,6’-三羟基-4-甲氧基查尔酮（4）： 将2.13g（0.014mol） 2，4-二羟基苯乙酮溶解在25ml无水乙醇中，逐滴滴入5ml 50% KOH，然后分批少量加入2.13g（0.014mol）香兰素，在30℃下搅拌反应，用TLC 检测至反应完全。将反应物倾入碎冰中，用1M HCl 调PH值至2，静置，用CH2Cl2 萃取，有机层合并后水洗，旋转蒸发蒸去溶剂，得棕黄色固体粉末2.08g，产率51.8%，熔点79-80℃。MS：m/z=151 ( 100%)。IR：3433cm-1, 1614cm-1。1H NMR：δ=3.87（s, 3H, OCH3）,  6.44~6.95（m, 3H, ArH）, 7.43（d, 1H, CH）, 7.85（m, 3H, ArH）, 7.91（d, 1H, CH）, 12.70（s, 1H, OH）, 13.50（s, 1H, OH）。

2.2 合成查尔酮对葡萄糖苷酶的抑制作用

2.2.1 材料

对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG), Sigma (St. Louis, MO, USA)公司产品；

-葡萄糖苷酶(-D-Glucosidase), Sigma(St. Louis, MO, USA)公司产品；

合成的查尔酮系列化合物。

2.2.2 仪器与试剂

UV-2450型岛津紫外-可见分光光度计；数字酸度 I 离子计；可调式移液器。

丙酮，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠等均为市售国产分析纯试剂；

所有测试用水皆为二次蒸馏水。

2.2.3 实验方法

-葡萄糖苷酶活性的测定：

将一定量的-葡萄糖苷酶溶液（0.3mg/ml）加入到pH=7.28 0.05M的磷酸盐缓冲溶液中，于37℃下恒温约30分钟, 加入50μL对硝基苯酚葡萄糖苷溶液（2mg/ml），混合均匀后测试λ=400nm处的吸光度随反应时间的变化。以在本实验条件下每分钟释放1.0μmol PNP为一个酶活力单位。

黄酮类物质对-葡萄糖苷酶的抑制作用：

分别吸取5μL、8μL、10μL、12μL、15μL、18μL、20μL黄酮类抑制剂溶液（0.2mg/ml），50μL 0.3mg/ml -葡萄糖苷酶溶液加入到pH=7.28 0.05M 的磷酸盐缓冲溶液中，于37℃下恒温约30分钟，加入50μL 2mg/ml 的对硝基苯酚葡萄糖苷溶液，混合均匀后测试λ=400nm处的吸光度随反应时间的变化。以黄酮类抑制剂溶液浓度为横坐标，-葡萄糖苷酶活力(以OD400值表示)为纵坐标作图。

2.3 合成查尔酮对-葡萄糖苷酶二级结构的影响

2.3.1 材料

-葡萄糖苷酶(-D-Glucosidase), Sigma(St. Louis, MO, USA)公司产品；

合成的查尔酮系列化合物。

2.3.2 仪器与试剂

J-810 圆二色谱仪；数字酸度 I 离子计；可调式移液器。

丙酮，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠等均为市售国产分析纯试剂；

所有测试用水皆为二次蒸馏水。

2.3.3 实验方法

分别吸取不同量的抑制剂溶液（2mg/ml）及50l的-葡萄糖苷酶溶液（3mg/5ml） 溶于pH=7.28的0.05M的磷酸盐缓冲溶液中，在JASCD J-810圆二色谱仪上测试，扫描范围（180-300nm）。

3．结果和讨论

3.1 合成查尔酮对葡萄糖苷酶的抑制效果

图I表明，查尔酮1~3对葡萄糖苷酶的抑制效果非常微弱，几乎没什么抑制作用，查尔酮4的抑制作用相对较强，其IC50为73.12μM。造成抑制效果差异的其原因可能是查尔酮1~3分子结构较简单，而查尔酮4含羟基较多，结构更复杂，与酶活性部位能够更好地结合。

3.2 合成查尔酮对葡萄糖苷酶二级结构的影响

由图II可以看出，查尔酮1~3这三个无明显抑制效果的抑制剂对葡萄糖苷酶二级结构中的螺旋影响不大，而有抑制效果的查尔酮4则使220nm处的凹槽减小，即降低了葡萄糖苷酶中的螺旋含量。

一般来讲，蛋白质以-螺旋的形式存在，疏水性增加，有利于形成疏水性的活性区域，保证酶完成催化功能。-螺旋含量降低，在一定程度上说明酶稳定性减弱，使得酶催化效率降低，即降低了酶的活力。这也从一个方面说明了查尔酮类抑制剂是通过改变酶的二级结构或动态构象来影响酶的催化活性的。

3.3 合成查尔酮对非酶糖基化的抑制作用

Ⅲ 合成查尔酮对非酶糖基化的抑制效应

由图III所示，查尔酮类化合物对蛋白质非酶糖基化具有不同程度的抑制作用，而且抑制效果随着化合物溶液浓度的增加而普遍增强，这说明抑制率和化合物浓度呈正相关。Charlton4的抑制效果最好，IC50为36.8μM ，而Charlton1~3的抑制效果则差得多，IC50均大于75μM。

3.4 总结

通过比较四个查尔酮化合物对葡萄糖苷酶及蛋白质非酶糖基化的抑制效果，可发现查尔酮4这个抑制活性较好的化合物在A环上保留了两个羟基，而查尔酮1~3这三个抑制效果不好的化合物在A环上没有羟基，因此推断A环上羟基的存在有利于提高抑制效果；羟基数目越多，抑制效果越好。

Limasset[9]等用体内和体外方法揭示了查尔酮结构中的酚羟基是消除自由基的功能基团。SAR还表明，A环上的C4’、C6’二羟基对氧自由基的作用是必要的。消除自由基的能力还与分子中酚羟基的数目和取代基烷烃链的位置、长短密切相关。B环C3、C4羟基也有利于对氧自由基的作用。因此，我们的实验结果与Limasset是相一致的。

参   考   文   献

[1] Kumar, S.K.; Hager, E.; Pettit, C. J.Med.Chem. 2003, 46: 2813.

[2] Hsieh, H.K.; Lee, T.H.;Wang, J.J. Pharm. Res. 1998, 15: 39.

[3] Viana, G.S.; Bandeira, M.A.; Matos, F.J. Phytomedicine. 2003, 10: 1.

[4] Murakami, S.; Muramatsu, M.; Aihara, H. Biochem. Pharmacol. 1991, 42: 1447.

[5] Wu, J.H.; Wang, X.H.; Yi, Y.H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13: 1813.

[6] Bekhit, A.A.; Habib, N.S.; Din, A. Boll. Chim. Farm. 2001, 140: 297.

[7] Lopez, S.N.; Castelli, M.V.; Zacchino, S.A. Bioorg. Med. Chem. 2001, 9: 1999.

[8] Liu, M.; Wilairat, P.;Go,M.L. J. Med. Chem. 2001, 44: 4443.

[9] Limasset B, Doucen C, Dore JC, et al. Effects of flavonoids on the release of reactive oxygen species by stimulated human neutrophils. Biochem Pharmacol, 1993,46(7):1257-1271.

致谢

首先感谢创新基金的大力支持，使我有机会开展本次实验。          

    其次感谢马林教授对本实验提出的建设性意见，以及古练权教授和黄志纾教授对本实验给予的帮助。

    本实验的顺利完成离不开王渝芳师姐的悉心指导。感谢李满妹师姐完成实验中的非酶糖基化测定。

    另外实验室的其他同学和师兄师姐在实验过程中也给予了非常热心的帮助，在此我向他们表示最真诚的感谢！