实验一培养基的配制

实验目的

1. 明确培养基的配制原理。

2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。

实验内容

学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。

实验原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96℃以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。

培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。

牛肉膏蛋白胨培养基配方

牛肉膏    3.0 g

蛋白胨    10.0g

NaCl      5.0g

水        1000mL

pH        7.4~7.6

高氏I号培养基配方

可溶性淀粉  20g

NaCl   0.5g

KNO3   1g

K2HPO4·3H2O   0.5g 

MgSO4·7H2O    0.5g

FeSO4·7H2O    0.01g

琼脂   15—25g

水     1000mL 

pH     7.4~7.6

马铃薯培养基配方

马铃薯（去皮）                         200g

葡萄糖（或蔗糖）                       20g

琼脂                                   15~25g

水                                     1000ml

自然pH

察氏培养基配方

蔗糖                                   30g

NaNO3                                  2g

K2HPO4                                 1g

KCl                                    0.5g

MgSO4·7H2O                           0.5g

FeSO4·7H2O                            0.01g

琼脂                                   15~25g

蒸馏水                                 1000ml

自然pH

LB培养基：（大肠杆菌用）

胰蛋白胨10g/L

酵母提取物5g/L

NaCl 10g/L

琼脂粉15g/L

用1moL/L NaOH调节pH

枯草芽孢杆菌常用培养基配方：

1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+15g琼脂

实验器材

牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeS04·7H2O，马铃薯，蔗糖等。

试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙， pH试纸(pH 5.5~9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

实验步骤

1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法

(1) 称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。

(2) 溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时．需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。

(3) 调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用mol/LHCL进行调节。

    对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。

 pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整PH。

(4) 过滤

    趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。

(5) 分装

    按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。

1) 液体分装：分装高度以试管高度的l／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。

2) 固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

3) 半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

图1-1 培养基的分装

                         A 漏斗分装装置 ；B 自动分装装置 

1 铁架 ；2 漏斗 ；3孔胶管 ；4弹簧夹 ；5玻璃 ；6流速调节 ；7 装量调节 ；8开关

分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。

(6) 加塞

图1-2  棉塞的制作

培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。

 (7) 包扎

 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

(8) 灭菌

    将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌。

(9) 搁置斜面

    将灭菌的试管培养基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多〕，将试管口端捆在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 。

(10) 无菌捡查

将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24—48h，以检查灭菌是否彻底。

2．高氏I号培养基配制方法

(1) 称量和溶化

    按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0.01g／ml，再在1000mL培养基中加1mL的0.0l g／m1的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。

(2) pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。

3．马铃薯培养基配制方法

取去皮马铃薯200g，切成小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包扎、0.1MPa灭菌20 min。

4．察氏培养基配制方法

方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

实验结果及讨论

针对实验原理、步骤、现象进行讨论。

实验作业（选做3题）

1．牛肉膏应置于何种容器中称量为宜?

2．配制高氏合成一号培养基时，可溶性淀粉需经什么处理后才能倒入到沸水中? 

3．何谓培养基的自然pH?

4．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的

5．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?

6．配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需要另加微量元素?

7．有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时要注意各种营养成分的比例?

8．你配制的高氏I号培养基有沉淀产生吗?说明产生或未产生的原因。

9．细菌能在高氏I号培养基上生长吗?为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施?