中药药理学实验课

题目：延胡索提取物的镇痛作用

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指导老师：

延胡索提取物的镇痛作用（方法的研究）

一、延胡索镇痛的历史[1]

   罂粟科紫堇属延胡组植物延胡索的块茎。 根据南北朝以来直到明清的医案记载和现代科学研究，可把延胡索的临床应用分为三类：1.镇痛作用：延胡索中多种生物碱对胸部疼痛、胃肠疼痛、腹部疼痛、跌打扭伤等有显著的止痛作用;2.治疗心血管疾病：延胡索对心血管疾病有肯定的药效，能扩张冠脉，治疗心率失常;3.用于妇产科通经、行气：可治疗痛经和产妇产后宫缩痛。

　　现代药理实验证明，延胡索对中枢神经系统具有明显的抑制作用，能使肌肉松弛，并具有解痉作用。口服延胡索可产生类似吗啡及可待因的效果，能缓解一般神经痛、头痛、腰痛、关节痛、月经痛、肿疡疼痛等。延胡索对轻度痉挛性疼痛的有效率大致与杜冷丁相当。另外，延胡索还有镇静、催眠、抗惊厥的功效。

　　延胡索的研究新发现 

以中科院上海药物研究所金国章院士为代表的药理学家以中西医结合的方式对延胡索进行了系统、深入的研究，发现其主要成分延胡索乙素的镇痛、镇静机理与传统的麻醉性镇痛或消炎解热镇痛机理不同，延胡索乙素是属于植物中枢多巴胺受体抑制剂，是一种增强内源抗痛系统功能的新作用机制，具有良好的镇痛、镇静作用，且安全性好，无成瘾性。

二、延胡索的主要功效及化学成分[2]

功效：延胡索有活血、理气、止痛功效和镇痛、抗心肌缺血、抑制血小板聚集

化学成分：延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丙素、延胡索丁素、延胡索戊素、延胡索己素、延胡索辛素、延胡索壬素、延胡索癸素、延胡索子素、延胡索丑素、淀粉、黏液质、挥发油及树脂

三、延胡索乙素的镇痛机理[3]

延胡索乙素生物活性最强，其左旋四氢巴马汀对脑内多巴胺（DA）受体有亲和力起通过阻断多巴胺DI受体增加脑内纹状体亮氨酸脑啡肽含量而产生镇痛作用。

  四、提取方法[4]

１、回流提取法：以延胡索乙素的提取量为考察指标，用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法测定其含量，采用正交试验优选提取工艺。结果优选工艺为，以３倍量７５％乙醇回流提取３次，每次提取1.5h,该提取工艺合理、转移率高。

2、动态逆流提取法：采用动态逆流提取法提取元胡中的延胡索乙素，并与渗漉法、回流法进行比较，结果在提高指标成分延胡索乙素的提取率及降低提取液的含固量基础上，减少溶剂消耗达５０％以上。该法具有提取完全、节省能源、可实现连续批量生产、缩短生产周期和工艺实用性强等特点，是一种比较科学的中药提取方法。

3、超声提取法:以氨一乙醚为溶剂，采用超声、冷浸、热回流３种方法提取延胡索，并以提取物生物碱中延胡索乙素提取量为考察指标进行比较研究。结果表明超声提取方法含量高、操作简便。

4、超临界ＣＯ2流体萃取法：技术是利用超临界ＣＯ2的高渗透性和高溶解能力来提取和分离物质的一种新的单元提取分离技术。

五、三种常用的镇痛试验方法[5]

热板法

试验目的与要求：

1.熟悉延胡索镇痛的主要成分及提取方法；

2.掌握三种常用的镇痛试验方法；

3.了解延胡索的一些研究新进展；

4．掌握热板测痛仪的使用。

试验原理及材料:

将小鼠置于恒温热板上，热刺激小鼠足部产生疼痛反应，以其舔足作为“疼痛”反应指标。当小鼠开始出现疼痛反应的时间作为小鼠痛阈值，比较各组间痛阈值的差异，判断药物有无疼痛作用。

动物：14只小鼠（雌性），体重18-22克

药物：生制延胡索、醋炙延胡索、生理盐水

主要器材：热板测痛仪，秒表，注射器等。

试验方法步骤：

1、给药前先测定每只小鼠的痛阈值(共测二次，以平均值为5-30s者为合格)

2、将9只小鼠编号分为3组：（生制延胡索组、醋炙延胡索组、生理盐水组）

3、给生制延胡索组、醋炙延胡索组、生理盐水组小鼠灌胃延胡索0.1ml/10g，30min后将恒温水浴调节至55±0．5。C，金属盘的底部接触水面，加热后作为热刺激，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(s)作为该鼠的痛阈值。给药后每隔0.5～1h测定一次，连续数次，如痛阈值超过60s,即停止测试而按60s计(时间过久，易烫伤足部)。

试验数据记录与处理:

实验结束，按所测之痛阈平均值计算痛阈提高百分率。

                       用药后痛反映时间-用药前平均痛反应时间

痛阈值提高百分率= ——————————————————— ×100%

                            用药前平均痛反应时间

    以时间为横座标，痛阈提高百分率为纵座标，绘出镇痛作用时程曲线，以分析药物的作用强度、作用开始时间和持续时间。

           2 室温对本实验有一定影响，以15～20℃为宜

           3 小鼠疼痛易躁动，注意安全。

思 考:影响热板法镇痛实验准确的因素有哪些？

扭体法

实验目的

1 掌握镇痛的实验方法

2 观察药物镇痛作用

实验原理

小鼠腹腔注射化学物质，可刺激腹膜引起腹腔深部大面积且较持久的疼痛，并引起小鼠”扭体“反应（腹部内凹，躯体与后退伸张等）。本实验以药物减少小鼠扭体反应的只数及次数作为指标，观察药物镇痛作用。

材 料

动 物：小鼠，体重18-22克，雌雄各半。

试 剂：生制延胡索、醋炙延胡索、生理盐水。

主要器材：秒表，注射器，鼠笼等。

方 法

取健康小鼠，雌雄各半，随机分为生理盐水组（等体积生理盐水），生制延胡索（灌胃10g/0.1ml生制延胡索水煎液）和醋炙延胡索组（灌胃10g/0.1ml醋炙延胡索水煎液）。给药后30min各组小鼠腹腔注射0. 6%醋酸液0. 2ml/只，记录15min内各组小鼠扭体反应的次数，并计算药物镇痛百分率。

给药镇痛百分率=（对照组平均扭体反应次数-给药组平均扭体反应次数）/对照组平均扭体反应次数×100%

1 醋酸有挥发性，应用时临时配；

2 每只小鼠腹腔注射部位和操作技术力求一致。

思 考:扭体法观察药物镇痛作用有哪些优点？

光照甩尾法

【原理】:

    鼠尾光照甩尾镇痛方法是通过固定强度的光束,持续照射到鼠尾产生集热效应,使鼠尾局部温度升高从而产生疼痛.当灼热产生的疼痛超过动物能忍受的痛阈时,动物会以甩尾来回避疼痛,以甩尾作为判断痛阈改变的指标,是镇痛药物筛选的物理性致痛方法之一.

【方法与步骤】:

    将大鼠或小鼠放入鼠固定器内,露出鼠尾然后紧固.待动物安静后,将尾部摆放在测痛仪光电控制探头中间的出光孔上,测定指示灯出现慢闪动,按“开始”键或踏下脚踏开关,计时开始,当鼠尾受热刺激疼痛摆动时,光源自动关闭,停止计时,锁定数据(痛阈值)并记录给药前后动物痛阈的变化.动物药物处理和测定时间同痛热板法.

数据处理:

给药镇痛百分率=（对照组平均扭体反应次数-给药组平均扭体反应次数）/对照组平均扭体反应次数×100%

【注意事项】:

    注意区别鼠尾自然摆动与痛刺激时甩尾的差异

参考文献

[1]马胜兴，等，延胡索研究概况。中医研究院西苑医院心血管病研究室，1985；5；12　 

[2]鲁春梅、张春森、姜立勇，延胡索化学成分及药理作用研究进展，2010；5；15

[3]金国章（中国科学院上海药物研究所）、胡江元（中国科学院上海生理研究所）2003；01

[4] 程建明、井山林，《时珍国医国药》；006；07　

[5]愈浩、胡勃、杨硕，延胡索、醋炙延胡索镇痛作用实验研究，2009；01