新型测序技术

1 随机切割基因组，将双链解旋，给单链的DNA加上接头。 

2 每颗珠子带有自己特有的单一的DNA片段，然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶颗粒中发生PCR反应，PCR在不同的地方终结使珠子带有同一DNA模板的不同拷贝的DNA。

3 洗去乳胶物质，使DNA变性，将带有单链DNA的珠子加入到光学纤维玻片（fibre-optic slide）上。

4 加入更小的带有焦磷酸盐测序所需酶的颗粒。

这里的蚂蚁就是这种光学纤维玻片了，它每个孔的直径大约44μm，边缘厚仅2-3μm，深55μm，每个孔的反应容量为75皮升，在1平方毫米的地方大概有480个这样的孔，你可以想象这些孔有多小。

整个测序的工作流程如上图所示，a是光学纤维玻片装载的地方，从ATGC瓶子来的溶液垂直流过开放的板面，在那里进行PCR反应，b是电荷偶联装置（charge-coupled device，CCD，扫描仪一般也采用这种原理成像）它负责捕获每个孔发出的光子，而c就是负责与人进行交互作用的电脑装置。

DNA测序技术上的快速发展，加快了我们对不同物种和生物体的基因组序列和结构的研究步伐。在已有GS 20的技术基础上，罗氏诊断公司和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了通量更大，读长更长，准确性更高的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，相信它的出现，必将掀起测序技术的进一步；对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。GS FLX是世界上第一个可以提供超高通量基因组和长片段DNA测序的商业化系统设备，只需要一步简单的全基因组样品制备过程，就可以在7.5小时内获得超过1亿个碱基信息。避免了目前技术中的大规模自动化技术的使用；单个人工就可以在几天内而不是几个月的时间里完成样品的准备，序列测定和结果生成整个过程。通过建立在PicoTiterPlate上的大量平行测序，采用最先进的图像处理技术和独特的数据分析可以获取高质量的结果。 

1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。

2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。

3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DN□段。

4）一条DNA段＝一个磁珠：接头使成百上千条DN□段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DN□段进行平行扩增。

5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DN□段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。

6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。

GS FLX系统的技术优势

GS FLX系统具备的卓越性能： 

• 一个测序反应耗时7.5个小时，获得超过1亿个的碱基数据

• 单个序列的读长更长，平均可达到200－300碱基左右

• 通量更高，每个反应可以得到超过40万个序列读长，成本大大降低

• 读长超过200 bp时，单一读长的准确性可以超过99.5%

• 测序结果一致性超过99.99%

• 技术成熟，提供完整的解决方案

• 可以进行Pair－End 测序研究

完整的软件包是GS FLX系统的又一特色：

• 简单易用的图形用户界面，可以用来进行作图，拼接和扩增产物差异检测等研究。

• 利用项目管理软件工具，可以把多次测序反应得到的数据进行成组分析，并且可以添加已完成的测序反应数据来进行其他方面的分析

• 利用新一代的算法得到高度可信的结果－无论是碱基识别， 拼接和作图，还是差异分析，都是如此。 

GS FLX系统的应用

自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户在Nature，Science，PNAS等世界顶级的期刊杂志上已经发表了五十多篇的学术论文。

454技术的出现，避免了载体的使用，解决了很多区域无法克隆的问题，使得基因组能均一地被测序，并且相对低的成本可产生很高的覆盖率，大大降低了gap size。但也有很明显的缺点，无法解决homopolymer的问题。

Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（ SBS － sequencing by synthesis ），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。

technology: solexa sequencing technology

This breakthrough platform is based on massively parallel sequencing of millions of fragments using our proprietary Clonal Single Molecule Array technology and novel reversible terminator-based sequencing chemistry. The intrinsic characteristics of the approach and the design of the Illumina Genome Analyzer System combine to produce a highly robust, accurate, and scalable system that sets a new standard for productivity, cost-effectiveness, and accuracy among next-generation sequencing technologies.

The approach relies on attachment of randomly fragmented genomic DNA to a planar, optically transparent surface and solid phase amplification to create an ultra-high density sequencing flow cell with > 10 million clusters, each containing ~1,000 copies of template per sq. cm. These templates are sequenced using a robust four-color DNA sequencing-by-synthesis technology that employs reversible terminators with removable fluorescence. This approach ensures high accuracy and avoidance of artifacts with homopolymeric repeats. High sensitivity fluorescence detection is achieved using laser excitation and total internal reflection optics. Short sequence reads are aligned against a reference genome and genetic differences are called using a specially developed data pipeline. Alternative sample preparation methods allow the same system to be used for a range of other genetic analysis applications, including gene expression and small RNA discovery.

Genome analyzer highlights 

∙Reduced project cost: Enables sequencing at 1% the cost of conventional technology

∙Ultra-high throughput: Generates up to a billion bases of usable data per run?00x the throughput of conventional methods

∙High accuracy: Delivers accurate, high-confidence data, even in homopolymeric regions

∙Easy, automated operation: Straightforward protocols require no beads, no emulsion, and allow walk-away operation for up to 72 hours

∙Application versatility: From DNA sequencing to digital expression profiling and small RNA discovery, the Illumina Genome Analysis System enables you to take on a broad range of applications rapidly and economically