壳聚糖酶高产菌株的筛选_产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化

壳聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件的优化及壳聚糖

酶的分离纯化

孙菲，陈山岭，李宜海，郑孝贤，梁智群

（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）

摘要：从采集的土样中分离到3株产壳聚糖酶的菌株,经摇瓶复筛,菌株JH01产酶能力最强。对其发酵产酶条件的研究结果表明其产酶最适培养基组分为: 壳聚糖2.0% ， NaCl 0.05% ，MgSO40.05% ，KH2PO4 0.075% ，FeSO4 0.001% ，牛肉膏 0.3%，pH 5.5。最适产酶培养条件为:4 0℃、180r/min培养48ｈ。在最适产酶培养条件下，48ｈ时菌株JH01发酵液中壳聚糖酶活力可达到26.03U/mL，产酶能力为国内已报道的最高值。经DEAE Cellulose 52柱层析，壳聚糖酶被纯化了11.70倍。经SDS-PAGE鉴定，纯化后酶已达到电泳纯的程度，分子量为30kD。

关键词：壳聚糖酶；筛选；发酵条件；纯化；

Screening, Optimization of Fermentation Conditions of Chitosanase Producing Strain and Purification of Chitosanase

Sun Fei, Chen Shan-ling, Li Yi-hai, Zheng Xiao-xian, Liang Zhi-qun

(Life science and technology college of Guang Xi University, Nanning530004, China) Abstract: Three strains producing chitosanase were isolated from soil samples. Shaking cultivation demonstrated that the strain named JH01 possessed the highest chitosanase activity. The optimal composition of medium for JH01 producing chitosanase was as follow: chitosan 2.0% , NaCl 0.05% , MgSO40.05% , KH2PO4 0.075% , FeSO4 0.001% , beef extract 0.3% , and pH 5.5. The optimal cultivation conditions for JH01 producing chitosanase were 40℃ incubating temperature and shaking cultivation at 180r/min for 48 hours. The maximal chitosanase activity could reach 26.03U/mL when JH01 was incubated in flask under the optimal cultural conditions. Chitosanase from JH01 was purified about 11.70 fold by DEAE Cellulose 52. The purified enzyme is demonstrated by SDS-PAGE to be a hormogenous protein. The molecular is determined as about 30 kDa by SDS-PAGE.

Keywords: Chitosanase; Screening; Fermentation conditions; Purification

壳聚糖由氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成，其水解产物壳寡糖具有独特的生理活性和功能，如抑制肿瘤的生长[1]、抗真菌[2]、抗细菌[3]等。在医药品、保健品、农业、食品方面具有广泛的应用前景，其应用引起了国内外的广泛关注。

目前国内制备壳寡糖的方法主要有酸水解法和混合酶水解法。这两种方法寡糖得率低、水解产物混杂、分离困难，且对环境污染严重。而壳聚糖酶能特异性作用于GlcN-GlcN、GlcNAc-GlcN 、GlcN-GlcNAc 糖苷键，将壳聚糖水解成聚合度为2~8的寡糖，条件温和、产率高、污染小，因此研究壳聚糖酶成为目前壳聚糖降解发展的方向。

收稿日期：2006-2-22

作者简介：孙菲，在读研究生。通讯联系人：梁智群教授

国外对产壳聚糖酶的Bacillus属和Streptomyces 属的许多菌株已经作了较多的研究，在酶的纯化方法，作用机理，理化性质等方面有了许多报道。国内关于壳聚糖酶的研究较少，只有关于球孢白僵菌Beauveria bassiana [4]、细菌属假单孢菌Pseudomonas sp.ＶⅢＴ39[5]、青霉菌[6]和Aspergillus sp.CJ22-326[7]产壳聚糖酶的分离、纯化和性质研究报道。

本文报道了壳聚糖酶产生菌的筛选、产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

DEAE Cellulose 52为whatman公司产品；电泳用的相对分子质量标准蛋白质为Pharmacia公司产品；

21壳聚糖 ( 脱乙酰度为80% )为北海文珂海洋生物科技开发公司提供；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 土样：从广西省采集供菌种分离

1.3 培养基

初筛培养基(平板分离培养基)：壳聚糖 1.0%，NaCl 0.05%，MgSO40.05%，KH2PO4 0.075%，FeSO4 0.001% , (NH4)2SO4 0.3% , 琼脂2％，pH 6.5。

复筛培养基(液体筛选培养基)：壳聚糖 1.0% , NaCl 0.05% , MgSO40.05%，KH2PO4 0.075% , FeSO4 0.001% , 蛋白胨 0.3%，pH 6.5。

斜面种子培养基：马铃薯20%，蔗糖2%，琼脂2%，pH自然。

液体种子培养基：马铃薯20%, 蔗糖2%，pH 自然。

1.4 产酶菌株的筛选

1.4.1 初筛方法

将采集的土样稀释后涂布于初筛平板，挑选生长情况良好、透明圈较大的菌落作为复筛对象。

1.4.2 复筛方法

将初筛菌种接至PDA斜面28℃培养2d，环接至液体筛选培养基中，28℃振荡培养2d后，测各发酵液中的酶活力，取酶活力最高的作为进一步的产酶试验菌。

1.5 壳聚糖酶的浓缩与纯化

1.5.1 发酵液的浓缩

将菌种接种于PDA斜面培养基37℃培养1.5d，环接至种子培养基40℃,180r/min培养2d，按接种量15%接至发酵培养基40℃,180r/min培养2d。发酵液经真空抽滤收集上清液。上清液放于透析袋中,埋入蔗糖，4℃过夜。

1.5.2 DEAE Cellulose 52离子交换层析

将浓缩后的发酵液上样于用0.05mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)预平衡的DEAE Cellulose 52离子交换层析柱(2.8×20cm)，用0~0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1.5mL/min，收集有酶活力的组分进行蔗糖浓缩。

1.6 壳聚糖酶活力的测定

取0.1 mL粗酶液与5 mL pH 5.0的2.5％的壳聚糖溶液混和，60℃保温30min，沸水浴5min灭酶活。以6mol/L NaOH溶液调反应液pH>10.0，离心除去未反应的底物。3,5 二硝基水杨酸(DNS)法测定酶解液中的还原糖(以氨基葡萄糖计), 在本实验条件下,每分钟产生相当于1µmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位。

1.7 蛋白质含量测定

采用Bradford法[8]，以牛血清蛋白质作标准蛋白质。1.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：按文献[9]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

平板培养2d后，筛选到3株菌株可以在以胶体壳聚

糖为唯一碳源的固体培养基上生长，并产生透明圈，

编号分别为JH01，JH02，JH03。

2.2 菌株复筛结果

对培养2d后的菌株的D/d值（透明圈直径/菌落直径）进行了测定，并进行摇瓶复筛。结果表明JH01在

液体培养基中的产酶能力最强(见表1)。

表1 摇瓶复筛结果

编号D/d d(cm)

酶活力（U/mL）JH01

JH02

JH03

2.38

1.03

1.12

1.06

1.01

1.12

6.81

0.002

0.011

2.3 产酶条件优化结果

2.3.1 壳聚糖浓度对产酶的影响

在壳聚糖浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的液体培养基中，28℃、180r/min培养2d，结果

见图1。发现当壳聚糖浓度在2.5%以上时，反而抑制

壳聚糖酶的产生，当壳聚糖浓度为2.0%时，酶活最高。

图1 壳聚糖浓度对产酶的影响

2.3.2 氮源对产酶的影响

壳聚糖浓度2%时，在原复筛培养基中除去氮源，

分别考察以0.3％的(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨为氮源时的产酶能力。实验表明

以牛肉膏为氮源效果最好（见表2）。

表2 氮源对产酶的影响

氮源种类(NH4)2SO4KNO3NH4NO3尿素牛肉膏蛋白胨

酶活(U/mL) 5.33 2.17

2.08 4.29

10.47

9.4 2.3.3 温度对产酶的影响(如图2)

发酵培养基壳聚糖浓度为2%，以0.3%牛肉膏为

氮源。设定培养温度为24℃、28℃、32℃、36℃、40℃、44℃、180 r/min下培养2d后取样检测酶活力，结果

如图2。随着温度升高而上升，36℃~40℃酶活较高，40℃达到最大值，但超过40℃时酶活力下降。因此产

22

23

酶最适宜的培养温度为40℃。

源于60h 、72h ｈ达

2.3.5 图4 发酵起始pH 对产酶的影响

把发酵培养基的pH 值分别调为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，接入同量菌种，40℃下振荡培养2ｄ后测定酶活力，结果如图4。pH 为5.0~5.5时酶活力较高, pH 为5.5时该菌产酶能力最强，酶活力最高。当起始pH 值高于5.5时，产酶能力明显下降。 2.4 DEAE Cellulose 52柱层析

壳聚糖酶经浓缩、DEAE Cellulose 52柱层析纯化后，结果见表3。表3知纯化后壳聚糖酶比活力提高至

361.30U·mg -1，

纯化倍数为11.70倍，酶回收率为66.3%。由图5，6可以看出经过DEAE Cellulose 52柱除去了两个较大的杂蛋白峰。纯化后的壳聚糖酶在SDS-PAGE 下只有一条蛋白质谱带，这表明酶纯化后达到了电泳纯的程度。根据壳聚糖酶相对迁移率(Rm)值对照标准样品的标准曲线得出，该纯化酶相对分子质量是30KD 。

表3 粗酶液壳聚糖酶的纯化

纯化步骤

总酶活/U 总蛋白 /mg 比活 /U•mg -1 纯化

倍数 得率/% 粗酶液 8.2520.992 30.88 1 100 蔗糖浓缩 574.3516.174 35.51 1.15 88.6图5 发酵液浓缩后经DEAE cellulose 52离子交换柱洗脱后

（0.5 mol/L NaCl 洗脱）的酶活

(▲)和蛋白质（◆）曲线

M I

M-低分子量质量标准蛋白;I-壳聚糖酶

3 结论

壳聚糖酶是一类差异较大的水解酶类，不同来源的壳聚糖酶其酶学性质也不同。国内外对真菌来源的壳聚糖酶报道较少, 仅有Pencillium islandicum , Mucor rouxii , Fusarium solani , A.oryzae , A.fumigatus , Trichoderma reesei , Rhodotorula gracillis 的壳聚糖酶的纯化和部分性质的研究报道。国内对来源于真菌的壳聚糖酶分离纯化的报道只有Pencillium sp 、Beauveria bassiana 和Aspergillus sp.CJ22-326。

(下转第20页)

4 小结

(1)瞬时高压作用对枯草杆菌具有一定的杀灭效果，芽孢相对比较难以杀灭，在25℃、120MPa下处理1次，枯草杆菌的致死率为93.82%。瞬时高压作用对其产生的破坏效应主要是生物效应，且产生的致死作用是不可逆的。

(2)在相同的进料温度和作用次数下，随着处理压力的提高，枯草芽孢杆菌的致死率上升。提高进料温度对其杀灭效果也有所改善，但效果不明显。

(3)在处理过程中，瞬时高压对枯草杆菌的致死率随着处理次数的增加而上升，且提高处理次数比提高压力的效果更明显。

(4)酸性和碱性条件下较中性下更有利于瞬时高压杀菌，酸性条件下杀菌效果最好。

(5)蛋白质对菌体有一定的保护作用，随着蛋白质浓度的提高，保护作用越强。

(6)糖类对瞬时高压下的菌体也有保护作用，在一定浓度范围内，糖液浓度愈高，对菌体保护作用愈强。

参考文献

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(上接第23页)

本文从土壤中筛选出一株壳聚糖酶高产菌株。该菌株在2.0%的壳聚糖培养基上生长旺盛且产酶能力较强，最高酶活可达26.03U/mL，远远高于国内目前已报道的微生物的产酶能力，其酶活为国内最高[10]。来源于该菌株的壳聚糖酶纯化方法简单，仅用DEAE Cellulose 52就可以达到电泳纯的程度且得率高，具有非常好的工业应用前景。此研究中虽未测定壳聚糖酶的pI，但离子交换层析的结果表明该壳聚糖酶pI＜5.0，为酸性蛋白。

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