实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

一、目的

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

二、原理

考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。

三、仪器、试剂和材料

1．仪器

 （1）分析天平

 （2）具塞刻度试管 × 8

 （3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I

 （4）研钵

 （5）漏斗

 （6）离心管     10ml

 （7）容量瓶     10ml

 （8）离心机

 （9）721型分光光度计

2．试剂

 （1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 0.1mg／ml的原液。

 （2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月。

3．材料

 绿豆芽

四、操作步骤

1．标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。

2．样品中蛋白质含量的测定

（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。

（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：

  样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））

六、注意事项

 比色应在出现蓝色2 min～l h内完成。

七、思考题

 ．考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？

 ．如何正确使用分光光度计？

 参考文献

鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981

文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994

张龙翔．生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981