微生物学实验教案

实验一、显微镜的使用；细菌的简单染色法；革兰氏染色法

一、目的要求

1.学习并掌握油镜的原理和使用方法。

2.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

3.学习并掌握革兰氏染色法。

4.初步认识细菌的形态特征。

5.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、基本原理

1.油镜的工作原理

油镜的使用需在载玻片与油镜镜头之间加滴镜油（通常是香柏油），其主要原因如下：

（1）增加照明亮度

油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载玻标本的玻片透过来的光线，因介质密度的不同，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使使用油镜时会因射入的光线较少，物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时需在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率相仿的镜油。

（2）增加显微镜的分辨率

显微镜的分辨率是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，显微镜的分辨率受光的干涉现象和所用物镜性能的，可表示为：

分辨率（最大可分辨距离）=λ/2NA。式中λ=关波波长；NA=物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围，而数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n﹒sinα。式中α为光线最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达1200，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率比空气和水的折射率要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值要高于低倍镜、高倍镜等干镜。所以油镜的分辨率增加。

2.细菌的简单染色法

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

常用碱性染料进行单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易识别。常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、碱性复红等。

3.革兰氏染色法

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram 发明的. 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色， 再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂番红复染.经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性细菌(G+)；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的红色，该菌属于革兰氏阴性细菌(G-).

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色；G-则不同，由于其细胞壁肽聚糖曾较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

三、器材

1.菌种 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物， 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物，细菌三型玻片标本。

2.溶液或试剂 香柏油，革兰氏染色液。 

3.仪器或其他用具 显微镜， 酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，檫镜纸，生理盐水等。

四、操作步骤（示范）

1. 细菌的简单染色法

（1）涂片 取两块载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片，用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取小许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

（2）干燥 室温自然干燥

（3）固定 涂面朝上，通过火焰2～3次。

（4）染色 滴加染液于平放的玻片上。草酸铵结晶紫染色约1min,番红染色约2min。

（5）水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

（6）干燥 

（7）镜检

2.革兰氏染色法

（1）制片 取枯草芽孢杆菌（或金黄色葡萄球菌）和大肠杆菌培养物常规制片、干燥、固定。

（2）初染 滴加结晶紫染色1-2min,水洗。

（3）媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗。

（4）脱色 将玻片倾斜，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般为20～30s。

（5）复染 用番红液复染约2min，水洗。

（6）镜检 干燥后用油镜观察。

3.显微镜的使用

（1）观察前的准备

（2）显微观察

①低倍镜观察

②高倍镜观察

③油镜观察  在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，是油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。

（3）显微镜用毕后的处理

①上升镜筒，取下载玻片。

②用擦镜纸擦区镜头上的油，然后用擦镜纸蘸小许乙醇与乙醚的混合物擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦净纸擦去残留的乙醇与乙醚的混合物。

③用擦净纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

④将各部分还原，同时八聚光镜降下。

五、实验报告

1.结果

（1）绘出三种细菌及细菌三型中的螺旋菌的形态图。

（2）简述细菌的革兰氏染色观察结果。

2.思考题

（1）用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加什么油？起什么作用？

（2）你认为制备细菌染色标本时，尤其应注意哪些环节？

（3）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？

（4）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

（5）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。

实验二 荚膜染色法；细菌运动性的观察；微生物大小的测定；显微镜直接计数法

一、目的要求

1.学习并掌握荚膜染色法。

2.学习用压滴法观察细菌的运动性。

3.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。

4.明确血细胞计数板计数的原理。

5.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、基本原理

1.荚膜染色法

荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在水冲洗时被除去。所以常用负染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。

2.细菌运动性的观察

在显微镜下观察细菌的运动性可初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强，细菌和阿周围的液体难以区分。

3.微生物大小的测定

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具－测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

镜台测微尺是部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长10μm。镜台测位尺并不是直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。

目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。测量时需将其放在接目镜的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。

球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。

4.显微镜直接计数法

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片于载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积是1mm3。

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

设五个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则：

1ml菌液中的总菌数＝A/5×25×104×B=50000A﹒B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，则：

1ml菌液中的总菌数＝A/5×16×104×B=32000A﹒B（个）

三、器材

1.菌种 哈氏弧菌，酿酒酵母

2.染色剂 绘图墨水

3.仪器或其他用具 载玻片，盖玻片，滤纸，显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血细胞计数板，无菌毛细滴管。

四、操作步骤

1.荚膜染色法－湿墨水法

（1）制备菌和墨水混合液

加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量产荚膜菌菌体与其混合均匀。

（2）加盖玻片

将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后用滤纸吸去多余的混合液。

（3）镜检

2.细菌运动性的观察－压滴法

（1）制片

挑取一环菌液于载玻片上，用镊子取一洁净盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后慢慢放下盖在菌液上。

（2）镜检

3. 微生物大小的测定

（1）装目镜测微尺

取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

（2）校正目镜测微尺

①放镜台测微尺 将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。

②校正 用高倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，利用移动器移动镜台测微尺，使两尺再某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。

③计算 根据下列公式可计算出在高倍镜下目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度(μm)=两重合线间镜台测微尺格数×10/两重合线间目镜测微尺格数

（3）菌体大小测定

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片。用高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌宽和长所占目镜测微尺的格数，最后将测得的格数乘上目镜测微尺每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。

(4)测定完毕 取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。

4.显微镜直接计数法

（1）菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

（2）镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

（3）加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

（4）显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

（5）清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验报告

1.结果

（1）绘图说明你所观察的细菌的菌体和荚膜的形态。

（2）你所观察的细菌是否能够运动？

（3）将目镜测微尺校正结果填入下表：

（1）通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？

（2）为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

（3）在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？

（4）根据你的体会，说明血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

实验三 放线菌形态的观察；酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别；霉菌的形态观察

一、目的要求

1.初步了解观察放线菌形态的基本方法和放线菌的形态特征。

2.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

3.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；了解四类常见霉菌的基本形态特征。

二、基本原理

1.放线菌形态的观察

放线菌是指形成分枝丝状体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内的叫基内菌丝（基丝），基内菌丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（气丝），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下观察时，气丝在上层，基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。为了观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下形态特征。本实验用其中的扦片法。

扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

2.酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

3.霉菌的形态观察

霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约3～10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，本实验用下列两种：

直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石炭酸棉篮染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染液制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。

载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。

三、器材

1.菌种 细黄链霉菌，酿酒酵母，曲霉，青霉，根霉，毛霉。

2.培养基 高氏I号琼脂，察氏琼脂。

3.溶液或试剂 0.1％吕氏碱性美蓝染色液，乳酸石炭酸棉兰染色液，50％乙醇，20％甘油。

4.仪器或其他用具 无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U形玻棒，解剖针，解剖刀，镊子，显微镜等。

四、操作步骤

1. 放线菌形态的观察－扦片法

（1）倒平板 取融化并冷至50℃的高氏I号琼脂约20ml倒平板，凝固待用。

（2）接种 用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。

（3）扦片 以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角扦入琼脂内（扦在接种线上）

（4）培养 将扦片平板倒置，28℃培养3～5d.

(5) 镜检 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。

2. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别－美蓝浸片的观察

（1）在载玻片加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，然后滴加少量酵母菌菌悬液于染液中，混合均匀。

（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。

（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区分死活细胞。

3. 霉菌的形态观察－直接制片观察法

在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉篮染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开，盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。

载玻片培养观察法？

五、实验报告

1.结果

绘图说明你所观察到的放线菌、酵母菌和霉菌的形态特征。

2.思考题

（1）你根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌?

（2）你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？

实验四 培养基的制备；高压蒸汽灭菌

一、目的要求

1.明确培养基的配制原理。

2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。

4.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、基本原理

1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基是一种最广泛和最普通的细菌基础培养基。由于这种培养基中含有一般细菌所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

2.高压蒸气灭菌

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不断溢出，而增加灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

三、器材

1.溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/L NaOH,1mol/L HCl等。

2.仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷缸，量筒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），记号笔，麻绳，纱布等。

四、操作步骤

1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

（1）称量

搪瓷缸中加入水，按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入搪瓷缸中。

（2）溶化

用玻棒搅匀，然后加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

（3）调pH

在未调pH之前先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6.反之，用1mol/L HCl进行调节。

（4）过滤

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可省去。

（5）分装

按实验要求，可将配制的培养基分装于试管内或三角烧瓶内。

①液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

②固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

③半固体分装 试管一般以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。

（6）加塞

培养基分装完毕后，在试管口塞上硅胶塞，在三角烧瓶口上塞上棉塞。

（7）包扎

试管、三角烧瓶加塞后，试管10个一捆，在塞外包两层报纸，用麻绳以活结形式扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

（8）灭菌

将上述培养基以121℃，20min高压蒸气灭菌。

（9）搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管口端搁在玻棒或其他合适的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

（10）无菌检查

将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。

3.高压蒸气灭菌－手提式高压蒸气灭菌锅

（1）首先将内层锅取出，再向外层国内加入适量的水，是水面与三角搁架相平为宜。

（2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装的太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入塞子。

（3）加盖，并将盖上的排气软管插入到内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，物使漏气。

（4）用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升至所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。

（5）灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无菌生长，即可待用。

五、实验报告

1.结果

检查培养基灭菌是否彻底。

思考题

1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

2.在配制培养基的操作过程中应注意什么？为什么？

3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物。

4.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？

实验五 大分子物质的水解试验； IMViC与硫化氢试验；化学因素对微生物的影响

一、目的要求

1.掌握进行微生物淀粉水解试验的原理和方法。

2.了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

3.了解常用化学消毒剂对微生物的作用。

二、基本原理

1.大分子物质的水解试验－淀粉水解试验

微生物对大分子的淀粉不能直接利用，必须靠产生的胞外酶－淀粉酶将淀粉水解才能被微生物吸收利用。淀粉酶为水解酶，水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，使其能被运输至细胞内。这过程可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。

2.IMViC与硫化氢试验

IMViC是吲哚（indol test）、甲基红(methyl red test)、伏－普(Voges-Prokauer test)和柠檬酸盐(citrate test)四个试验的缩写。I是在英文中为了发音方便加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。

硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。

吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基笨甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍然维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6.因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。

伏－普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成3－羟基丁酮（乙酰甲基甲醇），此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏－普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。

柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌。而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0～7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。

硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检测常用的生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。

3. 化学因素对微生物的影响

常用的化学消毒剂主要有重金属盐及其盐类、有机溶剂（酚、醇、醛等），卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。重金属离子可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基相结合而使酶失活，重金属盐则是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生鳌合作用而使之变为无效化合物；有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内容物外溢；碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生强氧化剂也具有杀菌作用；染料在低浓度条件下可抑制细菌生长，染料对细菌的作用具有选择性，革兰氏阳性菌普遍比革兰氏阴性菌对染料更加敏感；表面活性剂能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使蛋白质发生变性。

三、器材

1.菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气肠杆菌，普通变形杆菌

2.培养基 固体淀粉培养基，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，产硫化氢培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基。

3.溶液或试剂革兰氏染色用Lugol’s碘液，甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂，2.5％碘酒，5％石炭酸，75％乙醇，1％来苏尔，0.25％新洁尔灭等。

4.仪器或其他用具 无菌培养皿，接种环，接种针，试管架，无菌滤纸片，吸管，三角涂棒等。

四、操作步骤

1.淀粉水解试验

（1）将固体培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

（2）用记号笔在平板底部划成两部分。

（3）将枯草杆菌，大肠杆菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在两部分写上菌名。

（4）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

（5）观察两种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，为阳性。

2. IMViC与硫化氢试验

（1）接种与培养

①用接种针将大肠杆菌、普通变形杆菌分别穿刺接入2支产硫化氢培养基中（硫化氢试验），置37℃培养48h。

②将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基（吲哚试验），4支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验），2支柠檬酸盐斜面培养基中，置37℃培养48h。

（2）结果观察

①硫化氢试验 培养48h后观察黑色硫化铁的产生。

②吲哚试验 于培养48h后的蛋白胨水培养基内加10～20滴乙醚，用力振荡，静置，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

③甲基红试验 培养48h后于2支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。

④培养48h后于另2支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％α－萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。若培养物呈红色者为伏－普反应阳性。

⑤柠檬酸盐试验 培养48h后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性，

3. 化学因素对微生物的影响

（1）将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。（2）用无菌吸管吸取0.2ml培养24h的大肠杆菌菌液加入到上述平皿中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

（3）将已涂布好的平板底皿划分成5等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。

（4）用无菌镊子将已灭菌的小园滤纸片分别浸入装有各种消毒剂溶液的滴瓶中浸湿。无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板贴有浸有无菌生理盐水的滤纸片为对照。

（5）将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放入37℃温室中，24h后取出观察抑（杀）菌圈的大小。

五、实验报告

1.结果

(1)将试验结果填入下表.“+”表示阳性反应, “-”表示阴性反应.

(1)你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶?

(2)解释再细菌培养中吲哚检测的化学原理,为什么再这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂,而不用丙酮酸?

(3)为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性,而产气肠杆菌为阴性?这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处?为什么会出现不同?

(4)含化学消毒剂的滤纸片周围形成的抑（杀）菌圈标明该区域培养基中的原有细菌被杀死或被抑制而不能进行生长,你如何用实验证明抑（杀）菌圈的形成是由于化学消毒剂的 抑菌作用还是杀菌作用?

(5)某公司推出一种新型饮料,并声称是100%纯天然产品,不含防腐剂,利用你所掌握的微生物学知识,试设计一个简单实验来初步判断此饮料是否含防腐剂?

实验六 微生物的分离与纯化

一、目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本技术。

二、基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有简易单细胞挑取法、平板分离法。

本实验用平板分离法。该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：

1.选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

2.微生物再固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长再平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验采用两种不同培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

三、器材

1.培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏培养基。

2.溶液或试剂 盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。

3.仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，庆大霉素，土样，显微镜等。

四、操作步骤

1.稀释涂布平板法

（1）倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基加热溶化，待冷至55～60℃时，马丁氏培养基中加入庆大霉素溶液（终浓度？2ml/1000ml），混匀后分别倒平板，每种培养基倒六皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拔出，三角瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml, 加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

（2）制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡约20min, 使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤悬液。

（3）涂布 将上述每种培养基的六个平板底部分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种

稀释度各两个，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min，使菌液吸附进培养基。

平板涂布方法：将0.1ml菌悬液小心地滴在培养基表面位置。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂几次。

（4）培养 将马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

(5)挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑少许细胞接种到上述两种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2.平板划线分离法

（1）倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称，土样编号和实验日期。

（2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单菌落。常用的划线方法有下列两种：

①用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约700角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线的部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作的三次划线和通过的三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

②将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

（3）挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

五、实验报告 

1.结果

（1）你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。

（2）在两种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。

2.思考题

（1）如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。

（2）如果要分离得到极端嗜盐菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。

（3）如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案（提示:产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈）。

试验七 多管发酵法测定水中大肠菌群

一、目的要求

1.学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。

2.了解大肠菌群的数量在饮用水中的重要性。

二、基本原理

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

1.初发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为了便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。

水样接种于发酵管内，37℃下培养 ，24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但液也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。

2.平板分离

平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远腾氏培养基，Endo’s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar, EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成的酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远腾氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。

3.复发酵实验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、器材

1.培养基 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。

2.仪器或其他用具 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。

四、操作步骤

1.水样的采取

应取距水面10～15cm的深层池水水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即检查。

2.池水的检查

（1）初发酵试验 将水样稀释成10-1与10-2。分别吸取1ml 10-2、10-1的稀释水样和1ml原水样，各注入装有10ml 普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml 原水样，分别注入5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。

（2）平板分离 经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

①深紫黑色、有金属光泽。

②紫黑色、不带或略带金属光泽。

③淡紫红色、中心颜色较深。

（3）复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中。每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管结果查表XV-3,将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水样的发酵管结果查表XV-4，即得每升水样中的大肠菌群数。

表XV-3大肠菌群检数表

接种水样总量111.1 ml (100ml、10ml、1ml、0.1ml各1份)

接种水样总量11.1１ ml (10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各1份)

1.结果

阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。

查表XV-3得每升水样中的大肠菌群数是多少？

查表XV-4得每升水样中的大肠菌群数是多少？

（1）大肠菌群的定义是什么？

（2）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？

实验八 平板菌落计数法；水中细菌总数的测定

一、目的要求

1.学习平板菌落计数的基本原理和方法。

2.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

3.了解水源水的平板菌落计数的原则。

二、基本原理

1. 平板菌落计数法

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞 。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚底阐述平板菌落计数结果，现在已倾向使用菌落形成单位（colony-forming units, cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。

2. 水中细菌总数的测定

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。

三、器材

1.菌种 大肠杆菌菌悬液。

2.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。

3.仪器或其他用具 1ml 无菌吸管，无菌平皿，灭菌吸管，盛有4.5ml无菌水的试管，灭菌的带玻璃塞瓶，试管架，恒温培养箱等。

四、操作步骤

1. 平板菌落计数法

（1）编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6（稀释度）各三套。另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

（2）稀释

用1ml 无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太快太猛，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依此类推。

（3）取样

用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各1 ml,对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。

（4）倒平板

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15ml /平皿，置水平位置上迅速转动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

（5）计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：

每毫升中菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

2. 水中细菌总数的测定

（1）水样的采取

应取距水面10～15cm的深层池水水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即检查。

（2）细菌总数测定

①稀释水样 取三个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，在自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别是10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需要继续稀释或减少稀释度。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度.

②自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释水样加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

③各倾注15ml 已融化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，立即放在桌上摇匀。

④凝固后倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。

(3)菌落计数方法

①先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

②首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表XV-1,例1）。

③若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则应取其中较小的菌落总数（见表XV-1,例2及例3）。

④若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表XV-1,例4）。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表XV-1,例5）。

⑥若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表XV-1,例6）。

表XV-1计算菌落总数方法举例

1.结果

（1）大肠杆菌菌悬液

将培养后的菌落计数结果填入下表：

（1）为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

（3）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？

（4）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？

实验基本操作考试