天然药物活性成分的研究(1)

班级：生化制药3092

姓名：刘香燕

前言：

迄今为止，临床应用的药物三分之一以上源自天然药物。它们直接来自天然药物或是以天然药物活性成分为先导进一步发展的衍生物、类似物或全合成产物。如阿司匹林，是从植物中广泛存在的水杨酸衍生而制成的乙酰水杨酸。局部普鲁卡因是根据植物可卡因的结构研究得到的。我们的祖先早在17世纪初就从无头中发现结晶体，但对它的系统研究还是欧洲化学家从19世纪开始的。19世纪初，化学家对鸦片进行了研究，分离得到了止痛成分吗啡与止咳成分可待因等多种生物碱。20世纪50年代，治疗高血压药利血平与抗癌药长春新碱的发明又一次掀起天然药物化学研究的热潮，从而促进了抗癌新药紫杉醇，喜树碱，依托泊苷及其类似物的问世。20世纪70年代，我国科学家从中药黄花蒿中发现抗疟新药青蒿素又引起了国际对中药研究的重视。

天然药物防治疾病的物质基础是其所含的具有防治疾病作用或生物活性的化学成分即有效成分，只有明确了天然药物的有效成分，才能为天然药物的成产，加工，质量控制，合理用药，扩大天然药物资源、进行化学合成和结构修饰、探索天然药物防治疾病的原理提供依据。

关键字：

研究的途径和方法：

1、确定目标    

 世界各国长期以来在使用天然药物防治疾病的过程中所积累的丰富经验是寻找新药的极为重要的源泉和基础。因此，研究药物的活性成分，首先要注意文献的调研和现有临床使用药物的效果，如历代医书上记载中药青蒿对“截虐”有效。 

2、活性筛选   

 研究天然药物活性成分时，首先应选择一种简便、快速、能反映天然药物治疗作用的药理活性测试方法，在分离的每一阶段对所得的各个组分进行活性评价。 

3、成分预试   

 a:单向预试    

即针对某一类成分而进行的检测，例如确证某一天然药物中是否含有黄酮类化学成分，采用适合于黄酮类化合物的提取溶剂提取，然后用黄酮类化合物的专属性试剂进行定性； 

 b：系统预试

即先用几种不同极性的溶剂分别对天然药物进行提取，再对各提取部位进行定性推测。 

4、提取分离

a：极性分离    

此方法是利用由小到大的各种有机溶剂对天然药物进行连续提取，把天然药物中的成分分成不同的极性部位。实际操作时，常先用甲醇（或不同浓度乙醇）提取。

b：单体分离     

在部位分离的基础上，可将性质相近的成分再进行细分，并利用各种色谱技术结合溶剂结晶法进行单体分离。

5、结构测定

a：纯度检查    

  在结构研究之前首先确定化合物的纯度。若纯度不合格，会给结构测定工作带来很大的难度，甚至导致结构测定工作的失败。

b：分子式确定    

 确定一个化合物的分子式，经典的方法是先进行元素的定性分析，检查含有哪几种元素，再测定各元素在化合物中的百分含量，从而求出化合物的实验式，然后根据测出的分子量，计算出该化合物的分子式。

c：推测结构     

 化合物的分子式被确定之后，就需要进行官能团和分子结构股价的确定。

结构测定中常用波谱简介

1、紫外吸收光谱   

       是用不同的波长的紫外光为光源（波长范围200~400nm），依次照射一定浓度的试样溶液，化合物分子因紫外线照射吸收能量而产生电子跃进，在不同波长下测定物质的吸收度，并用波长对吸收度或摩尔吸收系数作图而得到的吸收光谱图。

2、红外吸收光谱

       是化合物分子结构的客观反映，图谱中的吸收峰都对应着分子中化学键或基团的各种振动形式。

3、核磁共振谱

氢谱

     a：化学位移

化合物分子中不同类型H核，由于在分子中所处的化学环境（核外电子云和周围其他核的分布情况）不同，而引起的共振谱线位移。

b：信号的裂分及偶合常数

      磁环境不同的两个或两组`H核，在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使共振峰发生裂分。

c:峰面积

     峰面积以积分曲线高度表示。

   碳谱

4、质谱

       是化合物分子受一定能量冲击，失去电子，生成阳离子，而后在稳定的磁场中按质荷比（m/z）顺序进行分离，通过检测器记录而得的图谱。是确定化合物分子量，分子式及结构信息的重要手段。

材料与方法：

材料：

仪器：烧杯、三角烧瓶、回流装置、抽滤装置、分液漏斗、表面皿。

试药：天然药物原料（粗粉）、蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、滤纸、PH试纸、碘化铋钾、硅钨酸、鞣酸、苦味酸、HCI、H2SO4、NAOH、KOH、NH4OH、AICI3、FECI3、醋酐、氨基安替比林、铁、盐酸羟氨、溴钾氛绿、3,5-二硝基苯甲酸、a-萘酚、镁粉、乙酸镁、硫酸铜、茚三酮、明胶。

方法：

天然药物所含的成分是十分复杂的，为了减少预实验中各类成分的相互干扰，常常用不同溶剂，按照极性由低到高顺次提取，分别对各部分进行处理，然后进行各种成分的鉴别反应，列如取药材适量，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水甚至再用1%HCI溶液，1%NAOH溶液顺次抽提（即系统溶剂法），然后做鉴别反应。此方法手续较繁，更换溶剂前必须将上一次药材中溶剂挥干。为了简化手续，本实验采用数种溶剂，分别同时提取，然后检查其可能含有的成分。

                          药材粗粉

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5g                              10g     1g

 |                                |乙醇提取    |

提取液                           |                         提取液

（检查糖苷、氨基酸、蛋白质、          提取液          （检查挥发油、萜类、甾体及脂肪

有机酸、鞣质等水溶性成分）             |浓缩                类成分）

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                      |                      |

                    浓缩液          取2ml提取液     

                      |分两部分         （检查酚类化合物，有机酸类成分）

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             |                                     |

|                                     | 

          部分浸膏                              部分浸膏

             |加2%HCI溶解                              |EtOAc溶解

        |--------------------|                        EtOAc液

       酸液         残渣                           |加5%NaOH

   （检查生物碱类成分）   |乙醇溶解               |------------------------------|

                    乙醇液                 碱水层                 EtOAc层

                （检查黄酮、蒽醌等类成分）   （酚类化合物、有机酸类成分） |水洗至中性，蒸干

                                                                                            残渣

                                                                   |乙醇溶解

                                                                乙醇液

                                                     （检查香豆素、萜类、内酯类成分）

1.水提液  取药材粗粉5克，加10倍量的水，在50~60摄氏度的水浴上加热一小时过滤，滤液供检查氨基酸、多肽、蛋白质、糖、多糖、皂苷、苷类、鞣质、有机酸及水溶性生物碱。

（1）Molisch反应：试样1ml置于小试管中，滴加10%α-萘酚乙醇溶液1~2滴，振摇，倾斜试管，沿管壁加入浓H2SO4  0.5ml，试样中若有糖、苷存在，则两液交界处出现紫色环。

（2）Fehling反应：使用时，先将甲、乙两试剂（甲为硫酸铜溶液，乙为酒石酸钾钠与氢氧化钠的水溶液）混合成深蓝色的溶液，取其0.5ml加入待检溶液中，置水浴上加热2~3分钟，若还有还原糖存在则产生砖红色或黄色沉淀。

（3）PH试纸检查：取试样滴于PH试纸，如呈酸性，则指示试液中可能含有游离酸或酚性化合物。

（4）溴酚绿试验：取试样点于滤纸片上，喷洒0.1%溴酚绿溶液，立即在蓝色的背景上显黄色的斑点，示可能有有机酸存在。

（5）FeCI3试验：取试液1ml，滴加1% FeCI3试剂1~2滴，若结构中有酚羟基，则立即显蓝、绿、蓝黑或暗褐色，甚至有沉淀产生。（注意：若检液为碱性，可加入乙酸，酸化后在加入FeCI3）鞣质成分为常常易被水侵出，所以水浸液中FeCI3阳性反应，指示鞣质存在的可能性大。

（6）明胶试验：若FeCI3阳性反应，续作本项检查。取水浸液1ml，加入明胶试剂2~3滴，若产生白色沉淀或浑浊，指示为鞣质的反应；若不产生白色沉淀或浑浊，可能为其他非鞣质的酚性成分，如水溶性的黄酮类、生物碱类、蒽醌类、香豆素类等，有待进步检查。

（7）茚三酮试验：去检液1ml，于试管中，加入0.2%茚三酮的乙醇溶液后，在沸水浴上加热5分钟，冷后，如有蓝色或蓝紫色反应，表明有氨基酸、多肽或蛋白质。

（8）双缩脲反应：茚三酮反应若呈阳性，做本项试验。取试液0.5ml，加入1%氢氧化钠溶液1~2滴，摇匀，滴加1%CuSO4试验，随加随摇匀，观察颜色反应，如呈现紫色，红紫色表明含多肽或蛋白质。

（9）泡沫试验：去水浸液1~2ml于试管中，用手指堵住管口用力振摇2分钟，若产生多量泡沫，放置10分钟，如泡沫没有显著消失，其表明含有皂苷（高级脂肪酸的盐也发泡显著，长时间不消失，但天然存在的高级脂肪酸盐不及皂苷广泛），蛋白质和黏液质也能起泡沫，但经放置后，泡沫明显减少或消失。

（10）pH试纸检查：取试样滴于pH试纸，如呈酸性，示试液中可能含有游离酸或酚性化合物。

2.乙醇提取液  取样品粗粉10g，加5~12倍量95%乙醇在水浴上加热回流提取1小时，过滤，滤液留出2ml供检查酚类、鞣质和有机酸用；其余回收乙醇至无醇味，并浓缩成浸膏，浸膏分成两部分，一部分加少量2%HCl溶解过滤。分出酸液，供检查生物碱用，附在滤纸上的残渣再以少量乙醇溶解，供检查黄酮和蒽醌用；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解，溶液置分液漏斗中，加适量5%NaOH振摇，使酚性物及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中，剩下的乙酸乙酯为中性部分，用蒸馏水洗至中性，在水浴上蒸干，用乙醇溶解后供检查香豆素、萜类内酯用。

（1）FeCl3、溴酚绿试验方法参考水提液部分方法。

（2）生物碱的沉淀反应：取4只试管，分别加入药材醇浸膏的酸水液1ml(直接用药材的酸水液也行)，分别加入碘化铋钾试剂、碘化汞钾、硅钨酸试剂和苦味酸试剂个1~2滴，观察有无沉淀生成。

苦味酸试剂与生物碱的反应需在中性条件或微酸性条件下进行。若在强酸性条件下，苦味酸本身形成沉淀。

（3）三氯化铝试验：将乙醇提取液点在纸片上，喷洒三氯化铝的乙醇溶液，干燥后呈黄色斑点，在紫外光下观察，呈显著的黄色荧光，亦可能含有黄酮类。

（4）盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1~2ml，加浓盐酸4~5滴及少量的镁粉，在沸水浴上加热数分钟，如呈现红色，指示含有游离黄酮类或黄酮苷。如果被检溶液不加镁粉直接加浓盐酸就能产生红色，说明被检溶液中可能含有花色素。

（5）10%KOH液试验：将乙醇提取液几滴重复于滤纸片，干后喷洒10%KOH水溶液，如呈黄橙或红色荧光，亦可能含蒽醌类。

若在试管中进行也可得到同样的结果。取试液1ml，加入10%KOH溶液1ml，即呈红-红紫色，并有呈蓝色者，表示可能有羟基蒽醌或其苷存在。

（6）  乙酸镁试验：将乙醇提取液点在滤纸上，喷洒0.5%乙酸镁甲醇液，如呈橙红色或紫色（颜色随羟基位置及数目而定），说明有蒽醌存在。

       若无上述颜色反应，可将滤纸放在紫外灯下观察荧光，若产生天蓝色荧光，指示有二氢黄酮或二氢黄酮醇存在；若产生黄色或黄绿色荧光，指示有黄酮或黄酮醇类存在。

（7）  开环闭环反应：将乙醇提取液1ml滴于试管中，加入1%NaOH溶液2ml，于沸水浴中加热3~4分钟，溶液要比未加热之前澄清的多，加入2%盐酸酸化后，溶液又变为浑浊，说明有可能存在内酯结构的化合物。但应注意酚性化合物及有机酸的存在同样有此现象，所以还要结合分析才行。

（8）  盐酸羟胺反应：取盐酸羟胺甲醇溶液0.5ml，置于小试管中，加提取液数毫升，加2mol/L KOH甲醇溶液，使溶液呈碱性，在水浴上加热煮沸2分钟，冷却后，加1%FeCl3溶液1~2滴，然后滴加5%盐酸使溶液呈酸性，若有紫红色呈现，指示为阳性反应。

（9）  哥哥-氨基安替比林-铁反应：将试液滴于滤纸上，先喷洒2%4-氨基安替比林，再喷洒8%铁水溶液，即呈色，或再放入密闭缸内，缸内缸25%氨水，即产生橙红至深红色。

3.石油醚提取液  取样品粗粉1克，加10ml石油醚（沸程60~90℃）放置2~3小时，过滤，滤液检查挥发油、萜类、甾体类及脂肪等。

（1） 油斑试验：将石油醚提取液滴于滤纸上，在空气中能挥发，可能为挥发油；如果出现持久性的透明油斑，则可能为油脂。

（2）醋酐-浓硫酸反应：取乙酸乙酯提取液1ml，置于试管中（或小蒸发皿中），用1ml冰醋酸溶解，再加1ml醋酐，最后滴加一滴浓硫酸，试管颜色逐渐由黄—>红—>紫—>青—>污绿，指示为甾体母核的反应，植物中含甾体母核的成分较多，如皂苷、甾醇、甾体生物碱等。

 （3）25%磷钼酸乙醇溶液：石油醚溶液点在滤纸上，喷赛试剂后，115~118℃烘箱中放2分钟，对油脂、三萜及甾醇（有不饱和双键的）等能使试剂还原成钼蓝而呈蓝色，背景为黄绿色或兰青色。

结果：

1.在做天然药物化学成分预实验前，首先须熟悉天然药物主要结构类型的性质、检识反应，明确在天然药物提取分离的过程中，水提液、醇提液、石油醚提取液各部分所含的化学成分，对试验结果应综合进行判断。

2.检识反应时，如反应液因颜色深而难以判断，可将反应液用适当溶剂稀释后再观察，或将反应液滴在滤纸上观察。

3.若因成分间互相干扰，难以正确判断检出反应结果时，可进一步处理供试液，使各成分尽量分离。如反应液中成分含量太低时，可加大供试液用量，并适当浓缩，再做检识反应，必要时可做色谱检识。

4.试验的结果只能作为参考，因为有些反应为几类成分所共有的，有时由于成分间的相互干扰结果不明显或不正确。这可通过该成分的溶解度及层析行为给予综合性判断。在分析判断可能含有的化学类型时，不能仅凭一个方面的反应就下结论，应结合提取分离方法等多方面进行综合分析。

5.对于制剂成分的预实验可根据指制剂的制备工艺进行选择性的预实验，例如用水蒸气蒸馏法制成的有效制剂，可主要进行挥发油、内酯等成分的预试。又例如用水煎酒精沉淀法制成的有效制剂，可不必再进行蛋白质、多糖成分的预试。

讨论:

仙鹤草芽驱绦虫成分的研究

仙鹤草芽是蔷薇科植物龙芽草（Agrimonia Pilosa Ledeb.）根茎的芽。民间服用仙鹤草根茎芽的干粉治疗绦虫病，疗效显著；但经临床验证发现，水煎剂口服无效、醇浸后蒸去醇去渣（沉淀）服用无效，连渣服用有效。为了分离绦虫有效成分，首先选用了临床去绦虫作用基本一致的体外灭囊虫试验，作为寻找仙鹤草驱绦虫有效成分的药理指示，按图如下进行活性追踪。

                           仙鹤草干粉

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      |石油醚

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药渣（挥去石油醚）                                   石油醚提取物（+） 

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|三氨甲烷提取

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药渣（挥去三氯甲烷）               三氯甲烷提取物（—）

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药渣                    乙醇提取物（—）

结果，石油醚提取物示有明显体外灭囊活性。TLC检查示含有十几种酚性成分。将石油醚提取物随不同碱液作pH梯度萃取，在NaHCO3萃取部分分到有效成分鹤草酚（agrimophol）。最后经一系列化学降解及光谱测试，确定其结构，并经化学合成得到确认。