Binding Assay Protocol

01/04/10

Procedures for Binding Activity of Anti-MSPR Antibody

A.Reagents & Materials:

∙Test agent: Chimeric anti-MSPR antibody (MS20)

∙Antigen for coating: recombinant human MSPR-Fc (R&D Systems, Cat# 1947-MS-050)

∙Coating buffer: Sodium Carbonate, pH 9.5

∙Washing buffer: 0.05% PBS-T (0.5% Tween-20 in PBS)

∙Blocking buffer: 3% milk in PBS-T

∙Sample dilution buffer: 3% milk in PBS-T

∙2nd Ab-HRP: Goat F(ab') 2 anti-human kappa, HRP-conjugated (Biosource, Cat# AHI1804)

∙Substrate: TMB Peroxidase Substrate A (Cat# 50-76-02, Lot# ZE020)

∙Peroxidase Solution B (H2O2) (Cat#: 50-65-02, Lot# ZF051)

∙Stop solution: 1N H2SO4

B.Procedures:

1. Coat a 96-well plate with rhMSPR-Fc protein (100 ng/well) in 100l of coating buffer for O/N;

2. Wash the plate once with washing buffer;

3. Block the plate with blocking buffer (150 l/well) for 1 hour at RT;

4. Wash the plate once with washing buffer;

5. Adjust the anti-MSPR antibody to be 5 nM (750 ng/ml);

6. In a separate fresh plate, serially dilute the anti-MSPR antibody from 5, 2.5, 1.25, until 0.005nM;

7. Transfer the diluted antibody solution to the rhMSPR-Fc-coated plate;

8. Incubate the plate at RT for 1 hour on a rotator;

9. Washing the plate with washing buffer for 5 times;

10. Add 2nd antibody (Goat F(ab') 2 anti-human kappa., HRP-conjugated) at a 1:5000  dilution, incubate at RT for 1 hour;

11. Washing the plate for 7 times;

12. Prepare the substrate solution by mixing TMB Substrate A and Substrate B at 

         the ratio of 1:1;

13. Add the substrate (100 l/well), and incubate at RT up to 10 minutes or until the 

        color is changed to blue;

14. Add 50 l of Stop solution to stop the reaction;

15. Determine the absorbance at 450 nM in a standard plate reader.