气相色谱法分析海洋沉积物中多糖的组成3

气相色谱法分析海洋沉积物中多糖的组成3

何碧烟　戴民汉 　曹　莉 　徐　立 　黄　伟 　王新红

(集美大学　厦门　361021;厦门大学海洋环境科学教育部重点实验室

厦门大学环境科学研究中心　厦门　361005)

(厦门大学海洋环境科学教育部重点实验室　厦门大学环境科学研究中心　厦门　361005)

提要　　碳水化合物是海洋有机质的主要组成部分,海洋中的碳水化合物主要以聚合物的形

式存在,其分子组成信息对研究它们的来源及其在生物地球化学循环中的作用具有重要意

义。作者应用毛细管气相色谱法分析了海洋沉积物中多糖的组成。利用210m ol/L三氟乙

酸,在80℃水解8h,把沉积物中的多糖水解成单糖,从而把单糖萃取到水相中。水解液在

60℃旋转蒸发除去三氟乙酸,用等量的阴离子和阳离子交换树脂混合柱脱除残留离子,以

Milli2Q水洗脱。洗脱液经蒸发、干燥后,用吡啶溶解,在012%LiClO4吡啶溶液催化下,于60℃

经48h达到互变异构平衡。平衡异构体经Regisil试剂衍生化成三甲基硅醚(T MS),用HP50

气相色谱仪进行分析。使用长30m、内径0132mm的HP25石英毛细管柱,配FI D检测器,进样

口和检测室温度保持在300℃,采用无分流进样,以N2作载气,流速为210ml/min,柱箱在

140℃保留4min,然后以2℃/min的速度升温到220℃,保留10min。以每种单糖的相对保留时

间定性;选择每种单糖中分离效果好、组成占优势的异构体峰面积作为单糖定量的依据,采用

内标标准曲线法定量。应用这一方法分析了厦门港沉积物样品,确定了沉积物中7种主要中

性单糖的组成。方法的样品加标准回收率为7710%—115%,相对标准偏差为118%—11%;空

白加标准回收率在9318%—113%之间,相对标准偏差为016%—915%;当信噪比为3时,各单

糖的检出限为0102—0106mg/L;内标戊五醇的全程回收率为7918%(n=6,RSD=512%)。

关键词　　毛细管气相色谱,多糖,沉积物

中图分类号　　P736

碳在海洋各贮库、各种形态之间的分布、转化和循环的速度以及碳由海洋表层转移到深层的通量是海洋生态系统中物质循环和能量流动的关键问题。研究碳在海洋的通量和循环对研究全球碳循环和与之密切相关的全球气候变化及其与人类活动的互动关系等都具有重要意义,已成为90年代国际海洋科学前沿研究领域的重要内容(陈泮勤等,1992)。沉积物中的有机物代表着海洋吸收外来物质的净埋藏,在全球碳收支平衡的定量化过程中起重要作用。

糖类物质是浮游植物光合作用的直接产物,在海洋生物地球化学循环中占有十分重

　　3国家自然科学基金资助项目,49976021号、国家杰出青年基金资助项目,49825111号、国家重点基础研究发展规划资助项目,G2000078500号。通讯作者:戴民汉,男,出生于1965年6月,教授,E2mail:mdai@xmu.edu.cn 收稿日期:2002206218,收修改稿日期:2003201206

要的地位(陈建芳等,2000),它们广泛存在于海洋沉积物中,是海洋沉积物有机碳的重要组成部分,通常占沉积物总有机碳的5%—20%(C owie et al ,1984a ;Bergamaschi et al ,1997)是沉积物中异养有机体的能量来源(Decho ,1990;T ibbles et al ,1994)。碳水化合物作为海洋初级生产力主要的光合产物,具有特定的组成和结构(K loareg et al ,1998;H oagland et al ,1993),因此沉积物中的多糖组成可作为沉积物中有机碳来源的示踪物(da et al ,2002;K erherve et al ,2002),可用于区分海源和陆源有机物(C owie et al ,1984a )。如陆源植物含有较高的戊糖(Ittekkot et al ,1986),浮游植物则含有较高的己糖(C owie et al ,1984a )。据Oades (1984)和G uggenberger 等(1994)的研究,阿拉伯糖(Ara )和木糖(Xyl )是植物的重要组成部分,半乳糖(G al )和甘露糖(Man ),特别是岩藻糖(Fuc )和鼠李糖(Rha )被认为是微生物的贮备糖。因此可以利用戊糖和己糖的比值结合G al +Man/Ara +Xyl 和Fuc +Rha/Ara +Xyl 的比值,区分不同来源的碳水化合物。

然而人们对沉积物中多糖确切的物理化学形态,如多糖的组成、结构、分子大小分布、及其与沉积物颗粒结合方式等知之甚少,其主要原因是沉积物中多糖组成复杂,而且通常都是或紧密或松散地与沉积物颗粒相结合(Miyajima et al ,2000),这给分离分析带来很大的困难。因此,建立高效快速分离分析沉积物中复杂的多糖组成的方法非常必要。

毛细管气相色谱法,因其分辨能力高、分析速度快和灵敏度高,被广泛用于分析食品和植物中多糖的组成。应用毛细管气相色谱法分析多糖中的单糖组成,需要把单糖转化

成挥发性衍生物后进行色谱分析,因为单糖在溶液中可能有几种不同的存在形式,如α、β2

吡喃环和α、β2呋喃环,因此会产生多重峰,给定量造成困难。Bethge (1966)和C owie 等

(1984b )利用LiClO 4做催化剂,使单糖在一定条件下,达到互变异构平衡,这样对每种单糖而言,各种异构体所占的比例就是确定的值,因此可以选择分离良好的单个色谱峰作为单糖定量的依据。

作者在Bethge 等(1966)和C owie 等(1984b )平衡异构化方法原理的基础上,对多糖水解分离方法进行了较大的改进,并优化了色谱分析条件,提高了方法的灵敏度和回收率,使之更适用于微量海洋样品中多糖组成的分析。

1　样品、仪器和试剂

沉积物样品采自厦门港,样品经冷冻干燥,再于60℃烘干24h 以上,使之充分干燥,用玛瑙研钵研细,过筛(80目)。标准单糖和内标(D 2阿拉伯糖、D 2半乳糖、L 2木糖、L 2岩藻糖、L 2鼠李糖、D 2甘露糖、D 2葡萄糖、戊五醇、山梨醇)均购自Sigma 公司,把它们溶于吡啶中,配成浓度为5g/L 的储备液,实验时稀释到所需的浓度;Regisil (双三甲基硅烷三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷)试剂购自Regis 化学药品公司;实验所用的水均为Milli 2Q 水;吡啶(分析纯),经重蒸后使用,其余试剂均为分析纯。组成分析使用HP50气相色谱仪。

2　实验方法

211　多糖的水解和分离

沉积物样品约为015g 置于带盖(内衬聚四氟乙烯薄膜)的玻璃瓶中,加入5ml 210m ol/L 三氟乙酸(TFA )水溶液,加盖密封,使用恒温电磁搅拌器,在80℃水浴中,磁力搅拌下水解8h 。以戊五醇(adonitol )做第一内标,离心分离(转速为4000r/min ,下同),沉淀用少量Mil 2li 2Q 水洗涤数次,合并上清液,60℃旋转蒸发除去TFA 。旋转蒸发后的残留物用约2ml

234　海　　洋　　与　　湖　　沼34卷

Milli 2Q 水溶解,过离子交换柱,以去除萃取物中的无机离子,柱内填充约20ml 等量的强酸

型和强碱型离子交换树脂混合物,以3倍量柱体体积的Milli 2Q 水洗脱。212　平衡异构化

经上述脱离子后的洗脱液,置于梨形烧瓶中,于60℃旋转蒸发到干,再在60℃油浴加热下,真空干燥(用油扩散泵抽真空),也可采用冷冻干燥,完全抽干水分。残留物用1100ml 吡啶溶解,取0125ml 置于带刻度的小试管中,加入一定量山梨醇(s orbitol )做第二内标,再加入等体积014%LiClO 4吡啶溶液,使LiClO 4最终浓度为012%,加塞密封,混合均匀后,在60℃放置48h 使异构化平衡。213　三甲基硅醚衍生物生成

在上述平衡异构体中加入0150ml Regisil 试剂,混合均匀后,于60℃反应15min ,单糖即可以完全转化成三甲基硅醚衍生物,用吡啶定容到所需要的体积,便可以进行色谱分析。

214　色谱分析

使用HP 25石英毛细管柱(内径=0132mm ;柱长=30m ;液膜厚0125μm );以N 2作载气,流速为210ml/min ,线流速为50cm/s ;柱箱在140℃保留4min ,然后以2℃/min 的速度升温到220℃,保留10min ;检测器为FI D ,检测室和进样口的温度均保持在300℃,进样量为1μl ,采用无分流进样,进样时,进样口先关闭1min 。

3　结果与讨论

311　水解条件的选择

分析多糖组成时需要先把多糖水解成单糖后进行分析,糖的种类不同,糖苷键类型不同,水解的条件也不同,因此选择合适的水解条件对准确测定多糖的组成非常重要,水解条件优选也因此成为多糖分析方法的研究热点。对于海洋沉积物或生物体样品,通常采用硫酸(H 2S O 4)或盐酸(HCl )水解,如Burney 等(1977)用0109m ol/L HCl ,Borch 等(1996)用0185m ol/L 的H 2S O 4进行水解,C owie 等(1984)用12m ol/L (72%)H 2S O 4在室温下预处理样品2h ,然后用Milli 2Q 水稀释到112m ol/L ,密封后在100℃下水解3h 。这些研究结果表明,对于某些样品H 2S O 4水解法优于HCl 水解法。Borch 等(1997)认为这是因为产生的CaS O 4沉淀减少了溶液的离子强度,因而使得后续的脱盐步骤更加容易。此外,作者认为HCl 挥发性大,不利于在加热条件下水解,使一些难水解的糖苷键不能完全水解是更重要的原因,也更能说明以上的实验结果。

本研究中采用210m ol/L 三氟乙酸(TFA )在80℃水解8h ,水解液经减压蒸发除去TFA ,避免了传统方法中的中和步骤,因为TFA 的沸点为7214℃,不像HCl 那么容易挥发,便于适度加热水解,其水解效果与H 2S O 4相当,但其沸点比H 2S O 4低得多,可以很容易通过减压蒸馏的方法除去,因此无须中和。根据作者的实验,不论是过去常用的Ba (OH )2中和法,还是改进后的CaC O 3或BaC O 3中和法,都不可避免地会因沉淀的吸附和共沉淀等原因造成糖类的损失。表1所列数据是作者利用TFA 水解法和C owie 等(1984b )的方法测得的第一内标戊五醇的全程回收率。可见TFA 水解法具有较高的回收率,且方法操作简便。

3期何碧烟等:气相色谱法分析海洋沉积物中多糖的组成235

表1　不同水解方法对戊五醇全程回收率的影响

T ab 11　E ffects of different hydrolysis methods on the recovery of adonital

水解法

回收率(%)

RSD (%)测定次数

TFA 水解法79185126C owie 等(1984b )法

5510

315

3

312　单糖平衡异构化和衍生化

单糖平衡异构化参照Bethge 等(1966)和C owie 等(1984)的方法:在60℃,012%LiClO 4吡啶溶液中平衡48h 。表2是利用单个标准单糖在上述条件下,测得的平衡异构体的组成,结果表明,每种单糖中各异构体的色谱峰面积占该单糖总峰面积的百分比(%T A )在多次测量中保持不变,说明各异构体已达到平衡。因为平衡异构体中,各异构体所占的比例在一定条件下是固定不变的,因此可以利用分离良好的单个异构体的峰面积作为单糖定量的依据。

表2　单糖平衡异构体的组成

T ab.2　Equilibrium isomer distribution

单糖色谱峰

rel RT %T A RSD (%)n

阿拉伯糖(Ara )

A 10.6857.52A 3

2

0.7632.62 1.81

3

A 3

0.849.87鼠李糖(Rha )R 10. 3.92R 320.7276.60 1.97

4

R 3

0.8819.40木糖(X yl )X 10.58 4.46X 20.9346.10X 3

3

1.1149.400.533岩藻糖(Fuc )

F 3

1

0.7413.480.48

4

F 20.8237.13F 30.9342.06F 4

0.967.32甘露糖(M an )M 3

1

1.2686.63 1.37

5

M 2 1.5913.36半乳糖(G al )

G 1 1.3313.90G 3

2

1.443

2.00 1.81

3

G 3 1.517.93G 4

1.5946.20葡萄糖(G lu )G lu 1 1.5445.10G lu 2

3

1.90

54.90

0.45

3

　　注:rel RT 是相对内标戊五醇的相对保留时间,%T A 为各异构体的色谱峰面积占该单糖总峰面积的百分比,RSD 为相对标准偏差,n 为测定次数,3表示用于定量的色谱峰

单糖与Regisil 试剂生成三甲基硅醚衍生物一般要求在无水条件下进行,衍生物密封

后尽快进行色谱分析,因为三甲基硅醚衍生物在潮湿的空气中容易被水解,因此后续的分析工作最好在48h 内完成。根据作者的实验,衍生化试剂的用量对异构体的数目也有影响,衍生化试剂用量不足,单糖平衡异构体的数目增加,这可能是因为单糖的羟基没有完

236　海　　洋　　与　　湖　　沼

34卷

全硅烷化造成的。与C owie (1984b )的方法相比,作者采用过量的衍生化试剂进行衍生化反应,这样可以降低样品对水分的要求,而且可以避免因羟基硅烷化不完全而使异构体数目增多。

图1　标准单糖三甲基硅醚衍生物(a )和沉积物

三甲基硅醚衍生物(b )色谱

F ig 11

G as chromatograms of T MS derivatives of m on osaccharide standards (a )and m on osacchrides in sediment from X iamen Hab our (b )11X yl1;21Rha1;31Ara1;41Rha23;51Fuc13;61Ara23;71Fuc2;81Ara3;9.Rha3;10.Fuc3+X yl2;11.Fuc4;12.Ad o ;13.X yl33;14.M an13;15.G al1;16.G al23;17.G al3;18.G lu1;19.M an2+G al4;20.S ob ;

21.G lu23

313　色谱分析的定性和定量

经过平衡异构化和衍生化后,每种单糖在HP 25色谱柱上分离得到色谱峰,多糖中所含单糖种类的定性采用与标准单糖的相对保留时间相对照的方法来确定,相对保留时间是标准单糖中各异构体色谱峰的保留时间与第一内标戊五醇的保留时间的比值。作者利用相对保留时间确定了海洋沉积物中7种主要的单糖,见图1a 、b 。

每种单糖用于定量的异构体的选择:首先,用于定量的异构体必须分离效果好,与其他单糖异构体的色谱峰没有重叠,以确保定量的准确性;其次,尽可能选择占优势的平衡异构体的色谱峰作为单糖定量的依据,以获得较高的分析灵敏度。单糖定量采用内标校正曲线定量的方法,标准曲线的制作是:把每种单糖和内标都配成5g/L 的吡啶贮备液,取一定量的标准

单糖贮备液稀释到所需的一系列浓度,加入一定量的戊五醇做内标,经过与样品同样的平衡异构化和衍生化后,进行色谱分析,根据图1a 、b 色谱峰的分离效果和表2单糖平衡异构体的组成,依据上述准则选择每种单糖中分离良好的占优势的异构体的峰面积(Ai )进行定量(见表2“3”标记的色谱峰),以Ai 与戊五醇的峰面积(As )的比值为纵坐标,标准单糖的质量(μg )为横坐标做标准工作曲线,利用标准工作曲线方程定量样品中的单糖含量,表3列出的是7种单糖的标准曲线方程和相关系数R 2值。314　方法的灵敏度和回收率

作者还通过优化色谱分析条件,

采用无分流进样技术,适度提高载气流速(210ml/L ),降低升温速率(2℃/min ),在保证分离效果的同时,提

3期何碧烟等:气相色谱法分析海洋沉积物中多糖的组成237

高方法的灵敏度。当信噪比为3时,本分析方法对每种单糖的最低检测限见表5,不同单糖的最低检测限不同,其值在0102—0106mg/L 。

表3　单糖的标准曲线方程

T ab.3　M onnosaccharide calibration equation

单　糖校正方程

R 2

阿拉伯糖(Ara )Y =0.0032x -0.04910.9984鼠李糖(Rha )Y =0.0047x -0.04610.9970木糖(X yl )Y =0.0032x -0.03030.9997岩藻糖(Fuc )Y =0.0009x -0.00410.9999甘露糖(M an )Y =0.0061x -0.04180.9995半乳糖(G al )Y =0.0022x -0.00320.9996葡萄糖(G lu )

Y =0.0034x -0.0286

0.9999

　　注:Y 为Ai/As ;x 为单糖的含量(μg )

表4　回收率测定的结果(n =4)

T ab.4　Recovery test (n =4)

测　定项　目Rha X yl Ara Fuc M an G al G lu 样品加标准回收率

样品含糖量(μg/g )

451546719199262755539加标量(μg/g )415419433402393401417测定值(μg/g )

511091070590577936737回收率(%)

10311592.998.288.181.077.1相对标准偏差(%)

3.811 5.07.07.1 1.8 2.3空白加标准回收率加标量(μg )206208214199195199201测定值(μg )

214235205198183197203回收率(%)

10411395.9.593.9.0101相对标准偏差(%)

0.6

5.6

8.6

5.1

1.6

2.5

9.5

表5　分析结果

T ab.5　Analytical results

单糖

测定值(mg/g 沉积物)

检测限LOD (mg/L )

最低定量浓度LOQ (mg/L )

Rha 0.4510.020.08Ara 0.7190.060.2X yl 0.5460.050.2Fuc 0.2620.060.2M an 0.1990.020.08G al 0.7550.050.2G lu

0.539

0.04

0.1

作者还测定了样品加标准和空白加标准的回收率。从实验结果(表4)可以看出两种方法测得的回收率对五碳糖基本上相似,对于六碳糖中的半乳糖和葡萄糖,空白加标准的

回收率相对要高些,表明样品的基质(sam ple matrix )对五碳糖的回收率没有明显的影响,

238　海　　洋　　与　　湖　　沼34卷

对半乳糖和葡萄糖有一定的影响。从表3的结果还可以看出,除了木糖外,各种单糖定量分析的相对标准偏差都小于10%。

作者还参照国际通用的质量控制法,选择戊五醇做第一内标(也称替代物),在样品水解后立即加入;山梨醇做第二内标,在样品平衡异构化前加入。利用第二内标计算第一内标的全程回收率为7918%,相对标准偏差为512%(测定次数n =6),符合40%—120%的质量控制要求,说明数据是可靠的。

315　分析结果

利用文中的方法对沉积物进行定性和定量分析,结果见图1和表5。图1a 是混合标准单糖三甲基硅醚衍生物的气相色谱图,图1b 是沉积物中多糖水解物的三甲基硅醚衍生物的色谱图,通过与7种主要单糖的色谱图进行比较,共鉴别了21个色谱峰。对沉积物定量分析的结果见表5。以信噪比为10所需的浓度作为最低定量分析浓度(LOQ ),对于不同的单糖其值在0108—012mg/L 之间(见表5),以至可计算出,在典型操作条件下,样品中单糖的

最低定量分析含量为011μg/g ,能够满足海洋沉积物多糖分析对检测限的要求,并可应用于

海洋生物体、悬浮颗粒物、胶体物质中多糖组成的分析。

参　考　文　献

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APP LICATION OF CAPI LLAR Y G AS CHR OMATOGRAPH Y TO

THE DETER MINATION OF THE COMPOSITION OF

POLYSACCH ARI DES IN MARINE SE DIMENTS

HE Bi 2Y an ,DAI M in 2Han ,C AO Li ,X U Li ,H UANG W ei ,W ANG X in 2H ong

(School o f Biotechnology ,Jimei University ,Xiamen 361021;Ministry o f Education ,Marine Environmental

Laboratory/Environmental Science Research Center ,Xiamen University ,Xiamen ,361005)

(Ministry o f Education ,Marine Environmental Laboratory/Environmental

Science Research Center ,Xiamen University ,Xiamen ,361005)

Abstract 　　Carb ohydrates ,m ostly occurring as polysaccharides ,represent a major com ponent of marine organic mat 2ter.T he com position of carb ohydrates at a m olecular level is applicable to distinguish marine 2from terrestrially 2derived organic matter and to understand their role in the carb on biogeochemical cycle.

We developed a gas chromatographic meth od to determine the com position of polysaccharides in marine sediments.P olysaccharides in sediments were hydrolyzed into m on osaccharides with 2.0m ol/L triflu oroacetic acid (TF A )at 80℃for 8h ours.T he hydrolysate was centrifuged and the supernatant was collected.T he s olution was then evaporated to rem ove TF A in a water bath at 60℃.T he dried sam ple was diss olved in approximately 2ml M illi 2Q water ,and then run through a 20ml column packed with mixed cation and anion exchange resins (1∶1mixture )at a flow rate of 0.8—1.0ml/min.T he column is then rinsed with at least three beds v olume of M illi 2Q water.T he deionized hydrolysate was evaporated to dryness ,upon which 0.2%(W/V )lithlum perchlorade was used to catalytically equilibrate sugar is omer mixture in pyridine at 60℃for 48h ours.Regisil (bis (trimethylsilyl )triflu oroacetamide +1%trimethylch orosilane )was then added to form trimethylsilyl ether derivatives of sugar.Each m on osaccharide was identified by its relative retention time ,and quantified by an internal standard meth od.Quantification on the basis of single clearly res olved peak for each sugar is made possible by this equilibration step.Analysis was carried out using a HP50gas chromatography equipped with a 30m by 0.32mm i.d.fused 2silica capillary column (HP 25)and with a flame ionization detector (FI D ).Both the injec 2tion port and the FI D are maintained at a constant tem perature of 300℃.T he injection was splitless with a constant col 2umn flow of 2.0ml/min of N 2.C olumn tem perature was programmed from 140℃increasing at 2℃/min after an initial delay of 4min.Under this condition ,seven major neutral m on osaccharides in the sediment sam ples taken from X iamen Harb our ,China were identified and quantified.

T he meth od sh owed a spiked recovery (sam ple +spike )of 77%—115%with a relative standard deviation (RSD )of 1.8%—11%,and a standard recovery (blank +spike )of 94%—113%with a RSD of 1.6%—915%.T he detection limit of the m on osaccharides ranged from 0.02—0.06mg/L with a signal to n oise ratio of 3.T he recovery of an internal standard ,ad onitol ,was 79.8%(n =6,RSD =5.2%)through out the sam ple processing procedure.K ey w ords 　　P olysaccharides ,Sediment ,Capillary gas chromatography

240　海　　洋　　与　　湖　　沼34卷