Western blot实验流程

一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，及头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。

二.药品配制：

1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：

2.42 g Tris base

            8g  NaCl

100ml H2O,  用HCl调pH 7.6 ，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween

2．TBS ：0.303 g Tris base  

0.4383g  NaCl (150mM)

         0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。

3．0.5M  Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。

1.5M  Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。

4．5×Running buffer pH8.3,500ml：

Tris-base   7.5g, 

Glycine(甘氨酸)  36g,

SDS    2.5g

加灭菌水至500ml, 4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。

5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：

8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许 灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光保存

6．10%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。

7.10%APS (ammonium persulfate，过硫酸铵(粉剂也保存在4°C)：100mg APS +1ml H2O,EP管中即可，4°C保存1周，-20°C保存1个月，时间长了胶难凝。.

8. 0.1% bromophenol blue dye溴酚蓝10ml

溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。

9. 2×Sample buffer(1:1)避光保存

   10%SDS   (1g/10ml)                  400μl

   0.5M Tris(pH6.8) (0.6055g/10ml)     250μl

   100% Glycerol(甘油，丙三醇)         200μl

   2-mercaptoethanol(巯基乙醇)         100μl

   0.1% bromophenol blue (10mg/10ml)   80μl

总计1030μl  避光4°C保存。

4×Sample buffer(1:1)避光保存：

10. 胶Stain Solution(蛋白染液):

100mgCoomassie Brilliant Blue G 250(考马斯亮蓝)溶于50ml95%的乙醇，加入100ml 85%的H3PO4,及50mlddH2O, 4°C保存于棕色瓶中。

Coomassie Brilliant Blue R 250(考马斯亮蓝-R250)：

       R250    0.5g

       甲醇     225ml    →定容至500ml

       冰醋酸   50ml

11. 胶Destain Solution(脱色液)for Coomassie Brilliant Blue：

acetic acid(冰乙酸)    100ml

methanol(甲醇)       100ml

加水至1000ml .

若转完膜后染色则不用10及11，改用12和13。

12.NC膜染色液：0.1%氨基黑染液：

氨基黑           0.2g

methanol(甲醇)    90ml

冰醋酸          20ml加水至200ml.

13．NC膜脱色液：

methanol(甲醇)    180ml

冰醋酸          4ml加水至200ml.

14．配转膜液(transfer buffer)：

  Tris                6.06g

  Glycine            28.8g

  Methanol (甲醇)     400ml

  DDH2O   to       2000ml，混匀后不用调pH值， 4℃保存。

(提前将前两种配成800ml，为2×transfer buffer转膜时取400ml加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可)。

注：所用水最好为灭菌的去离子水便于长期保存。

15.Tris-Gly 电泳缓冲液（5X）

Tris  15.1g

Gly    72.0g

SDS     5.0g

去离子水定容至1L，室温保存

三 实验步骤.

(一)提取蛋白并测蛋白浓度：

1．开离心机，4 °C ；

2.  配裂解液：   

   1mlTBS(pH至8.0)加入10μlNP-40,

1μlPepstatin(1μg/ml), 胃蛋白酶抑制剂A，溶于DMSO（二甲基亚枫），-20°C保存

1μlLeupeptin(1μg/ml), 亮抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存

1μlAprotinin(1μg/ml),抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存。

5μlPMSF(100μg/ml),phenyl methylsulfonyl fluoride ,苯甲基磺酰氟，溶于异丙醇（isopropanol），-20°C保存。

3．拿冰置于冰盒内，裂解液配好后即放于冰水上；

4．用1%戊巴比妥钠麻醉后取材，最好小于100mg，用冷TBS或冷生理盐水冲洗后（做蛋白最好灌流，做RNA要用70%酒喷毛，若不即用可在液氮中冷冻30min后，-70°C保存），加入裂解液(100mg/ml)，放于冰上，剪碎组织；剩余裂解液仍放于冰上，以备稀释样品用；

5．超声破碎，小烧杯内有冰，EP管置于冰水上，稳定并降温，4×10s，560W，间隔10S，超至无块状即可；

6．离心4 °C，12000g，20min离心机转动时打至time档性能稳定

7.蛋白定量：配标准蛋白，成倍数(根据药盒说明，有线性关系的浓度分别为0,0.15，0.3，0.6，0.9μg/μl ，因此0.3μg/μl 的标准蛋白各取0.5，1，2，3μl，并加入1ml染液；震荡混匀，测标品吸光值595nm，再由低浓度向高浓度测。做标准曲线，准备蛋白定量使用。

9．取超声破碎好的上清放于新EP管中，放于冰水上，取1μl加19μl ddH2O稀释20倍，从中再取1μl加入1ml染液，室温后5min，测吸光值，应在混匀后30min之内测完。

10．对标品用Excel做图，输入吸光值及对应浓度（包括空白），做散点图，完成图后添加趋势线，截距为0，公式及R2(相关系数)均选，得到相应公式（Y= B×X），再计算浓度即可，结果应×20(稀释倍数)。加样时每个孔应有50μg,用50/浓度即为加样量μl。样品即用可放于冰上，否则分装后放于-80℃。

补：7-10步测定蛋白浓度，也可以用买的蛋白定量试剂盒

补2：若样品为细胞样品时：（在冰上进行）

（不用蛋白定量的操作）

1、六孔板长满后，用PBS洗3遍，用裂解液和2X buffer1:1混匀的液体加入每孔100ul左右裂解。然后用刮刀刮下来，没刮一个孔要在三次水中洗一下刮刀。

2、煮30min，95℃。-20℃保存。用的时候拿出来化，离心取上清。

（需要蛋白定量的操作）

1、裂解用液为： 裂解液：抑制剂 = 1:1。收完蛋白后先离心，1000r/min，离心8min。吸出上清，弃掉沉淀。

2、96孔板，水  +  标准品（BSA，2mg/ml）总共20ul     蛋白（4ul） + 水（16ul）

         20ul      0

         19ul      1

         18ul      2

         16       4

         14       6

         12       8

         10       10

所有孔（即每孔）加100ul显色剂（BCATM:BCA) = 1：50混合），注意避光

3、37℃孵育40min

4、王黎明的程序里有BCA的程序测定（最后的配平用液也是裂解液：抑制剂=1:1）

5、定量的同时，同体积的蛋白和2Xbuffer一起煮30min，95℃.-20℃保存。

1．检查电泳所需的各种试剂和器械，并从4℃拿出药品；

2．清洗电泳所用的玻璃板（平时浸泡于洗洁精液中），擦酒精(70%)，晾干或60-70℃烤干；

3．装置电泳玻璃板（长板在内短板在外）并固定（卡住）；

4．配胶：之前先用水检查是否漏胶，两片玻璃要对齐，以免漏胶。  1.5mm玻璃板用7ml，1mm的玻璃板用5ml

加入浓缩胶,每边加满，立即插上梳子（平整面朝内，先一端插入，缓慢斜放至另一端插入）注意不要有气泡，可用70%酒精排出；等30min左右。加完浓缩胶立刻开始准备样品，并打开水浴锅，100℃；胶凝后（可见齿边缘与胶有空隙）垂直拔出梳子，两边同时用力；先用去离子水冲洗加样孔，再用Running buffer冲洗；

5．准备样品，每孔使用总蛋白量50微克，计算使用的样本量，根据loading buffer的浓度，加样量为10μl，即样本量(50/浓度)用裂解液补充总体积至5μl再加入5μl Sample buffer （2×），另有marker 和一个Sample buffer（1×），上样时加在一侧（防止跑歪），也可不用。（先加水，再加5μl Sample buffer，最后加蛋白），加完后离心再100℃水浴5min后放于冰上，准备上样。 两边两道buffer，左边一道marker。

6．放好电泳槽，将制好的胶板反过来（短面在内，如果跑单面胶，则放置好胶板后，另一面放塑料板，字面向内，夹紧），外加旧缓冲液Running buffer，两板之间加入稀释5倍的新缓冲液Running buffer(约用150ml，即35ml5×+140ml水)。上样。浓缩胶时80V，30min，分离胶时120V，45min（等条带齐了就可以换电压了）。（若在冰盒中电泳，时间可稍延长，但是浓缩胶一定要跑完才可以变电压再跑分离胶）。

(三)电泳转膜（冰上进行）

1．溴酚兰快达底部即可停止电泳；

2．(切下Marker及样品1、 2、3的胶，用Coomassie Brilliant Blut G(考马斯亮蓝)染色约30min（摇床）后用Destain脱色液脱色2h，并于凝胶成像中观察)此步可省，可在转完膜后，将膜剪下再用氨基黑染色（或者丽春红染色）；

3.配转膜液1000ml：取400ml 2×transfer buffer加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可；再加入1ml10％SDS利于转膜；或者10X转膜液：甲醇：双蒸水=1:2:7.

4. PVDF 膜预处理：

用甲醇浸泡1min→ddH2O 3个5min→转膜液浸泡15min

NC膜（nitrocellulose membrane，纤维素膜）(8.5×5.5cm)直接用转膜液浸泡10min

切4张8.8×5.8cm滤纸(Whatman 3mm层析纸),与海绵垫均用转膜液浸泡10min；切除浓缩胶(记清方向及要剪下染全蛋白的膜长度，并用铅笔标记于NC膜上)，将胶于转膜液中浸泡10min；

5．摆放顺序夹子黑色面+海绵(聚乙烯板)+2滤纸+凝胶（剪左角）+NC膜（不分正反面）+2滤纸+海绵+夹子白色面（三明治），注意每放一层用玻璃棒赶一次气泡，并要始终保持湿润，否则胶易碎；将三明治固定在转膜槽内，且夹子黑色面对转膜槽黑色面；一定要赶净气泡，否则会产生高背景或影响蛋白转移。

6．PVDF膜要在甲醇中浸没1-2min，然后在缓冲液中浸没5min再用。膜总是对着红色的那端。

6.转膜250mA，1.5h；电泳仪调至恒流（mA）；注意：三明治放于电泳盒内，并于盒底部放一磁力转子，三明治和盒壁间放置一冰盒进行转膜；放于有冰块的小盆内，放于磁力搅拌器上，中速； 

7.拿出PVDF膜，并剪去一角做标记；（可以在转膜前就剪角）

8.将Marker及样品剪下用氨基黑（丽春红）染色10min，再用脱色液脱色至背景干净为止(摇床，加盖)，放于凝胶成像中用可见光观察。

（四）与抗体结合：

1．将250mlTBS (25mlTBS×10+225ml灭菌的去离子水)+125μl Tween-20配置成含0.05%T的TBST，洗膜，5min/次，3次；注：洗时转速较快，但奶粉封闭及一抗、二抗要用最慢或稍快的速度，否则结合不上；

2.TBST配置5%的脱脂奶粉封闭液10ml，室温摇床封闭1-1.5h；封闭后用TBST洗15min+5min+5min

3.加入一抗，先摇床轻摇动20min，然后放置4℃过夜。

4. TBST洗膜15min+5min+5min；

5.加入1：5000二抗，室温摇动孵育1h；

6. TBST洗膜15min+5min+5min+5min；

7．化学发光.

8. 将PVDF膜保存在4℃，备用。

9．用较多的TBST再次洗膜，10min+10min；

10.5%脱脂奶粉室温封闭1h.可再进行免组。