输血科标准操作规程

1目的 检测供血者与受血者之间的输血相容性，包括主侧配血与次侧配血，确保输血安全。

2职责  血库工作人员负责执行

3适用范围  适用于盐水介质法、手工凝聚胺法和手工微柱凝胶法交叉配血全过程。

4操作规程

4.1原理

4.1.1盐水介质法

IgM类抗体可以在室温盐水介质中发生凝集反应，使用手工试管法可以判断供、受者间血液的相容性。

4.1.2凝聚胺法

凝聚胺交叉配血试验就是利用多聚季胺盐类—凝聚胺携带很多正电荷，中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，引起正常红细胞可逆性凝集。无抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，当加入中和液后，则凝集解散，而抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则不能解散，以此来判断供、受者间血液的相容性。

4.1.3手工微柱凝胶法

微柱凝胶卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗人球蛋白试剂，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶上端，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

4.2 试剂与器材

4.2.1试剂 凝聚胺配套试剂、生理盐水、微柱凝胶卡。

4.2.2 器材 血清学离心机、卡式专用离心机、光学显微镜、塑料软试管、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、玻片、移液器、一次性移液头。

4.3 标本要求

4.3.1.患者样本 EDTA抗凝全血或血清，全血量3～5ml，在1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血、无凝块、无明显乳糜。

4.3.2.供者标本 枸橼酸盐抗凝全血，全血量3～5ml，在1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血、无凝块、无明显乳糜。

4.4 操作步骤

4.4.1盐水介质法

4.4.1.1取两支试管，1支标明“主侧”；另一支标明“次侧”。

4.4.1.2按标记“主侧”管加受血者血浆1滴和供血者2%红细胞悬液1滴；“次侧”管加供血者血浆1滴和受血者2%红细胞悬液1滴。混匀，以1000转/ min离心1分钟，轻轻侧动试管，观察结果。冬季室温较低，应将试管保温，以防冷凝集素引起的凝集反应影响结果判断。

4.4.2凝聚胺法

4.4.2.1取试管2支，标明主、次侧，主侧管加受血者血浆（血清）2滴，供血者3～5%红细胞悬液（洗涤或不洗涤均可）1滴；次侧管加供血者血浆（血清）2滴，受血者3～5%红细胞悬液（洗涤或不洗涤均可）1滴。

4.4.2.2 每个试管分别加LIM液0.65ml，充分混合均匀后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均匀。

4.4.2.3用离心机3400转/min(相当于1000g离心力)离心10秒，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1ml液体。

4.4.2.4 轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做；

4.4.2.5 最后加入Resuspending2滴，轻轻摇动试管混合并同时观察结果。

4.4.2.6结果判定  

如果在60秒内凝集散开，代表是由Polybrene引起的非特异性凝集，配血结果相合；如果凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。如反应可疑，可进一步倒在玻片上用显微镜观察。

4.4.3手工微柱凝胶法

4.4.3.1按试验所需取相应张数（反应孔数）的凝胶卡，撕掉卡上的封口锡纸，剩余孔保留锡纸，在反应孔的下方分别标明患者姓名和主次侧。

4.4.3.2主侧孔先加献血者0.8%-1%红细胞盐水悬液50ul，再加受血者血浆（或血清）25ul；次侧孔先加受血者0.8%-1%红细胞盐水悬液50ul，再加献血者血浆（或血清）25ul。

4.4.3.3加样完毕，重新将锡纸盖好，将凝胶卡放入专用的孵育器37℃孵育15分钟。

4.4.3.4放入配套的专用离心机，按要求离心10分钟，观察结果。

4.4.3.5结果判读

若对照管细胞沉淀在管底，检测管凝集块在胶上或胶中判读为阳性。

若对照管和检测管的细胞沉淀均在管底判读为阴性。

若对照管细胞在胶上或胶中说明试验失败，应重新试验。

4.5检验结果可报告区间

相合或不相合

4.6 注意事项

4.6.1盐水介质法结果阴性，将原标本接着做凝聚胺法或抗人球蛋白法配血。

4.6.2 凝聚胺法

4.6.2.1离心后，倒掉上清液，不要沥干，让管底残留约0.1ml液体。

4.6.2.2 按照加样顺序进行结果观察，确保每一个反应结果都能在60秒内观察，否则弱凝集散开会出现假阴性。 

4.6.2.3若病人血清（血浆）含肝素，如洗肾患者，须多加4～6滴Polybrene溶液以中和肝素。

4.6.2.4 在冬天室温极低的情况下，操作交叉配血试验，某些病人血清中可能含有寒冷凝集等因素，而导致假阳性的结果出现。若有此怀疑，建议在最后滴入Resuspending时，将试管立即置入37℃水浴中，轻轻摇动试管混合，并在60秒内观察结果。

4.6.3手工微柱凝胶法

4.6.31 操作时，向反应腔内要先加红细胞，后加血清（血浆）。

4.6.3.2 如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。

4.6.3.3每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。

4.6.3.4红细胞悬液的浓度严格控制在0.8%-1%之间。

4.6.3.5试剂卡若长期放在4℃冰箱，每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。

4.7参考文献

4.7.1 凝聚胺试剂使用说明书。

4.7.2 叶应妩、王毓三、申子瑜.全国临床检验操作规程.中华人民共和国卫生部医政司，2006：262-265

4.7.3 汪德清、于洋.输血相容性检测实验室质量控制与管理.人民军医出版社，2011：218-219

不规则抗体筛查标准操作规程

1目的  检测受血者、孕妇等血清中是否存在抗A、抗B以外的不规则抗体，为交叉配血、ABO血型正确定型（不规则抗体干扰反定型）以及新生儿溶血病产前、产后诊断提供参考依据。

2 职责  血库工作人员负责执行。

3 适用范围  适用于盐水介质法、凝聚胺法、手工微柱凝胶法不规则抗体筛查。

4 操作规程

4.1 原理  

4.1.1盐水介质法

IgM类不规则抗体可以在室温盐水介质中发生凝集反应，使用手工试管法就可以判断受检者血液中是否存在IgM类不规则抗体。

4.1.2凝聚胺法

利用多聚季胺盐类—凝聚胺携带很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，引起正常红细胞可逆性凝集。无抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，当加入中和液后，则凝集解散，而被不规则抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则不能解散，以此来判断受血者血液中是否存在不规则抗体。

4.1.3微柱凝胶法

微柱凝胶卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗人球蛋白试剂，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶上端，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

4.2 试剂与器材

4.2.1 试剂  3系1%抗筛细胞（由3%抗筛细胞经专用稀释液稀释获得），抗人球蛋白凝胶微柱卡，生理盐水。

4.2.2器材  卡式专用离心机、孵育器、记号笔、移液器、一次性移液头、试管架。

4.3 样本要求

EDTA-K3或EDTA-K2抗凝静脉血≥3ml，在1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。

4.4 操作步骤

4.4.1盐水介质法

4.4.1.1取4支洁净试管分别做好标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、自身对照。

4.4.1.2每支试管中分别加入患者血浆2滴，再加入相应3%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛选细胞和自身红细胞各1滴并混匀。

4.4.1.3使用血清学专用离心机在1000g条件下离心15秒。

4.4.1.4结果判定：一系或多系红细胞发生凝集，自身对照不凝集的判断为阳性，提示存在IgM类不规则抗体。

4.4.2凝聚胺法

4.4.2.1取3支洁净试管分别做好标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

4.4.2.2每支试管中分别加入患者血浆2滴，再加入相应3%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛选细胞和自身红细胞各1滴并混匀。

4.4.2.3在每支试管中加入低离子液（LIM）0.65ml及凝聚胺（Polybrene）试剂2滴混匀，血清学专用离心机在1000g条件下，离心15秒。

4.4.2.4离心后弃上清，不要沥干，观察细胞扣，轻轻振摇，如果有凝集现象则加入重悬液2滴，拖拉辗转，1分钟内观察结果：3管中任意1管或多管出现凝集者为抗体筛选阳性，应进一步使用10系或16系谱细胞鉴定抗体的特异性，操作方法与筛查试验相同，同时应加自身对照。3管均无凝集为阴性。

4.4.2手工微柱凝胶法

4.4.2.1按试验所需取相应张数（反应孔数）的凝胶卡，撕掉卡上的封口锡纸，剩余孔保留锡纸，在反应孔的下方分别标明患者姓名和筛查细胞系别。

4.4.2.2先将3系1%抗筛细胞各50ul分别加入相应的反应孔中，再将患者血清（或血浆）25ul依次加入相应反应孔内。

4.4.2.3加样完毕，重新将锡纸盖好，将凝胶卡放入专用的孵育器37℃孵育15分钟。

4.4.2.4放入配套的专用离心机，按要求离心10分钟。

4.4.2.5目测并记录结果，任何一系或多系细胞出现阳性结果，抗筛结果即为阳性，应转入抗体鉴定试验。

4.4.2.6结果判读

若对照管细胞沉淀在管底，检测管凝集块在胶上或胶中判读为阳性。

若对照管和检测管的细胞沉淀均在管底判读为阴性。

若对照管细胞在胶上或胶中说明试验失败，应重新试验。

4.5检验结果可报告区间

阴性或阳性。

4.6 注意事项

4.6.1 凝聚胺法  离心后，倒掉上清，不要沥干，让管底残留约0.1毫升液体；按照加样顺序进行结果观察，确保第一个反应结果都能在1分钟内观察，否则弱凝集散开会出现假阴性；此法可能造成某些低效价或低反应活性的IgG类不规则抗体漏检。

4.6.2 标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。

4.6.3 微柱凝胶法操作时，向反应腔内要先加红细胞，后加血清（血浆）或抗体。

4.6.4 如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。

4.6.5 每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。

4.6.6 筛检细胞或谱细胞悬液的浓度严格控制在0.8%-1%之间。

4.6.7 试剂卡若长期放在4℃冰箱，每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。

4.7 参考文献

4.7.1 叶应妩、王毓三、申子瑜.全国临床检验操作规程.中华人民共和国卫生部医政司，2006：265

4.7.2 汪德清、于洋.输血相容性检测实验室质量控制与管理.人民军医出版社，2011：214～217

ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程

1目的  检测红细胞表面ABO血型抗原、RhD抗原及血清（或血浆）中抗A、抗B抗体，确定受检者ABO及RhD血型。

2职责  血库工作人员负责执行

3适用范围  适用于手工ABO血型及RhD血型鉴定试验。

4.操作规程  

4.1原理 

4.1.1手工试管法、玻片法或纸板法

根据红细胞膜表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正反定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型，是指用标准抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或（和）B抗原；所谓反定型，是指用标准A型细胞和B型细胞来测定血清中有无相应的抗A和（或）抗B。综合正反定型结果确定受检标本ABO血型。利用标准IgM抗D直接鉴定RhD血型。

4.1.2微柱凝胶法

ABO/RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶上端，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

4.2试剂与器材

4.2.1试剂 血型卡、生理盐水、抗A/B标准血清、抗D标准血清、3%-5%反定型试剂红细胞。

4.2.3器材 卡式专用离心机、血清学专用离心机、光学显微镜、塑料软试管、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、玻片。

4.3 标本要求

EDTA-K3或EDTA-K2抗凝静脉血≥3ml，在1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。

4.4 操作步骤

4.4.1试管法

4.4.1.1 ABO血型正反定型

4.4.1.1.1取两支洁净试管，做好标记，按试管标记向试管中加入抗A、抗B血清各1滴；再向每管中各加入5%被检红细胞盐水悬液1滴，混匀。

4.4.1.1.2 另取洁净试管3支，分别标明A、B、O细胞。用滴管分别加入受检者血清（血浆）1滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。

4.4.11..3 立即以1000r/min离心1min 。

4.4.1.1.4 将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集或溶血现象。如肉眼未见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜观察。

4.4.1.1.5 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。

4.4.1.1.6 凝集强度判断标准

4+：红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。

3+：红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。

2+：红细胞凝块分散成许多小块，周围可见到游离红细胞。

1+：肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。

±：镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。

MF：即混合凝集外观，是指镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞仍呈分散分布。

—：阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。

4.4.1.1.7按下表报告受检者红细胞ABO血型。

ABO血型正反定型结果

4.4.1.2.1取一支洁净试管,做好标记,加入抗D血清1滴。

4.4.1.2.2向试管中加入1滴3%～5%被检红细胞盐水悬液。

4.4.1.2.3轻轻混合试管内容物，经离心机在3400r/min条件下离心15秒（或1000r/min离心1min）。

4.4.1.2.4结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块。

4.4.1.2.5记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。

4.4.2 玻片法

4.4.2.1 ABO血型正定型

4.4.2.1.1取清洁玻片1张（或纸板1块），用蜡笔划成方格，标明抗A、抗B和抗A+B，分别用滴管滴加抗A、抗B和抗A+B分型血清1滴于相应的方格内，再各加受检者10%红细胞悬液1滴，混匀。

4.4.2.1.2将玻片（或纸板）不断轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约2min,肉眼观察有无凝集（或溶血）反应。如用玻片做试验时，也可用低倍镜观察结果。

4.4.2.1.3结果判断：凝集或发生溶血为阳性结果；细胞混匀2分钟后仍呈悬液状态的为阴性结果；对结果有怀疑，应用试管法重复实验。

4.4.2.1.4注意事项：玻片试验不适用于ABO反定型试验；不要混淆玻片边缘干燥的红细胞与真凝集。

4.4.2.2 RhD抗原定型试验

4.4.2.2.1加1滴抗D试剂于玻片上。

4.4.2.2.2再加1滴35～45%的被检红细胞悬液。该红细胞悬液可以是盐水悬液，也可以是悬浮于自身血浆或血清中的红细胞。

4.4.2.2.3在圆形的玻片区域中混匀，（直径约为20mm大小），前后缓慢摇晃玻片。2分钟左右肉眼判读结果。不要将试剂的干燥与凝集相混淆。

4.4.2.2.4如果呈阴性，需用试管法重做一遍试验。

4.4.3微柱凝胶法

4.4.3.1在检查合格后的血型卡下方注上被检者姓名、住院号等信息。

4.4.3.2将被检者红细胞配成0.8%～1%生理盐水红细胞悬液。

4.4.3.3轻轻撕开卡上盖膜，注意撕膜不要用力太猛，防止液体溅出导致各管之间出现交叉污染。小心加入已配红细胞混悬液至A、B、D、Ctl微孔管中各50ul，避免头接触到管壁或微孔管内容物。置于凝胶卡专用离心机进行离心10分钟，取出观察结果。

4.4.3.4读取结果；

若Ctl管的细胞沉淀在管底，检测管凝块在凝胶上读为阳性；

若Ctl管和检测管的细胞都沉淀在管底，读为阴性；

若Ctl管的细胞在凝胶上或凝胶中说明试验失败，应找明原因重新实验。可能红细胞悬液有凝块或红细胞自凝等原因，用生理盐水洗涤红细胞2-3次后再配置成红细胞悬液重复实验。

4.5检验结果可报告区间

4.5.1 ABO血型鉴定   A、B、O、AB型。

4.5.2 RhD血型鉴定   阴性或阳性。

4.6注意事项

4.6.1 分型血清质量性能符合商品合格试剂的要求，试验结束后应放置冰箱保存，以免细菌污染。

4.6.2 试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。

4.6.3 操作方法应按规定，一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核

实是否漏加血清。

4.6.4 IgM抗A和抗B与相应红细胞的反应温度以4℃为最佳，但为了防止冷凝

集的干扰，一般仍在室温（20℃-24℃）下进行试验，37℃可使反应减弱。

4.6.5 离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结

果。

4.6.6 观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。

4.6.7 凝胶卡使用前恢复至室温，检查血型卡上的微孔管出现下列现象时请勿使用：出现微生物污染或微孔管颜色发生改变时；微孔管顶部如出现分散的凝胶液滴，使用前对血型卡进行离心，若凝胶液滴无法下落时；出现气泡、微孔管上层液体干涸、凝胶体积减少或产生裂纹的血型卡时。

4.6.8 正反定型不一致的标本一律使用试管法重复试验。

4.6.9 对含有较多自身冷凝集素的受检者，在鉴定血型时往往被误定为AB型，遇到此种情况，需用37℃生理盐水洗涤受检者红细胞2-3次，以去除吸附在红细胞上的冷凝集素，然后再鉴定血型。

4.6.10 新生儿的血样中抗体含量较低，抗原发育不完全。同时可能含有母亲血液的抗A或抗B抗体，可能导致假阳性和假阴性的出现。

4.6.11 在许多病例中，ABO正反定型不符，必须在记录之前调查原因并解决问题。

4.6.12试剂一旦发现浑浊不得使用。

4.6.13判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。

4.7参考文献

4.7.1 叶应妩、王毓三、申子瑜.全国临床检验操作规程.中华人民共和国卫生部医政司，2006：246-247.

4.7.2 汪德清、于洋.输血相容性检测实验室质量控制与管理.人民军医出版社，2011：210-213.

4.7.3 抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）说明书.

4.7.4 RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）说明书.