细胞传代标准操作规程

一、实验名称：细胞传代培养

二、实验目的：传代培养细胞株

三、背景知识：

随着培养时间的延长和细胞不断，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞倍增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的相数／100个细胞。一般细胞指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

四、实验原理：

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

五、实验材料和药品：

（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。

（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞

六、实验步骤：

1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。 　　

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将实验所需培养基置37℃下预热。

3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。 　　

4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。 　　

5．点燃酒精灯；所有东西在进入超净台前需用75%酒精消毒。 　　

6．将培养基瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 　　

7．倒掉培养细胞的旧培养基。用适量的PBS液清洗培养瓶，以除去残留的旧培养基。 　　

8．每个大培养瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌减，使瓶底细胞都浸入到酶溶液中。肉眼观察，当见到瓶底有细胞滑落，酶溶液变浑浊时终止消化。一般室温消化时间约为1-3min。

9．加入少量的含血清的新鲜培养基终止反应，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，用弯头滴管转移至离心管中，1000r/s离心5min后弃上清液。加入2ml的新鲜培养基，吹打均匀后分装到新培养瓶中，加适量的培养基。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 　　

10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

七、注意事项：

1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰；每次最好只进行一种细胞的操作；每一种细胞使用一套器材；培养用液应严格分开。 　　        2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 　　

3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，并对培养环境做相应的处理。