MTT法检测细胞存活及生长

什么是MTT?　

MTT全称为-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

　　什么是MTT法?　又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 

　　MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

　　需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

　　MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.　配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g　

调pH 7.4定容1L

MTT法实验步骤

（一）贴壁细胞

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

（二）悬浮细胞：

1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的10（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 10）。

　　2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

　　4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

　　5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

基本原理: 基本原理 MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethyl thiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染 料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和 细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成 正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还 原生成的 formazan 结晶可用 DMSO（分析纯）来溶解。利用 酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值， 以反映出活细胞数目。

试剂配制： 试剂配制： MTT 溶液： pH=7.4 的 PBS 配制成 5mg/ml 浓度的溶液， 用 避光保存) MTT 法检测细胞存活率或抑制率详细步骤 1 接种细胞：用含 10％胎/小牛血清得培养液配成单个细 胞悬液，以每孔 10 -10 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100-200μl. 2:培养细胞：同一般培养条件，培养 1-2 天（原代细胞不 同，可根据试验目的和要求决定培养时间，神经元 7-10 35天，心肌细胞 8-14 天） 。 3 吸去原培养基， 每孔加入以无血清培养基配制的不同浓 度药物（原代细胞例外） 。 4 培养 24 或 48h 后， 每孔加 MTT 溶液 （5mg/ml， pH=7.4 用 的 PBS 配制，避光保存)10-20μl.（每孔培养基为 100μ l，加 10μl，每孔培养基为 200μl，则加 20μl） 。 5 37℃继续孵育 4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清 液（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液） 。 6 每孔加 150ul DMSO，振荡 10min，使结晶物充分融解。 7 比色：选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔 光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐 标绘制曲线。 注意事项： 注意事项： （1）MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就 可以。实验时一般关闭超净台上的日光灯来避光比较好。 （2）选择适当得细胞接种浓度。 （3）避免血清干扰：一般选小于 10％的胎牛血清的培养液 进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 （4）吸取上清时，需格外小心，切勿吸出孔底的蓝色的 formazan 结晶。 （5）空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对 照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心 （6）MTT 实验吸光度最后要在 0-0.7 之间，超出这个范围 就不是直线关系.