实验活动生物危害评估报告(汇编)

为保证实验室工作人员在工作中不被危害性生物及物品所侵害，保证危害性物品不外泄，对实验室工作环境进行评估，以鉴定生物安全防护等级，保证生物安全。

一、危害程度分类及生物安全防护水平评估

本实验室是为医院科研工作提供公共科研平台。生物源危害主要是由临床取材标本（如血液、组织等）中的微生物，尤其是病原微生物引起的，包括细菌、病毒、寄生虫等，具有潜在危险性，可能引起实验室感染；此外，实验室还存在触电、火灾、化学腐蚀、偷盗等危险。根据《实验室生物安全通用要求》，本实验室不涉及《人间传染的病原微生物名录》中高致病性微生物的分离培养及高致病性微生物的菌、毒种的保藏，实验室采用一定防护措施就能控制感染或防范灾害，或者对相应病原体存在有效的免疫方法。评估我实验室生物安全防护水平按二级实验室（BSL-2）生物安全要求。

二、实验室工作人员和实验室安全防护的一般要求

1. 吸烟危害评估及防护

（1）实验室工作区内绝对禁止吸烟；

（2）点燃的香烟是易燃液体的潜在火种

2. 实验区内食用食物、饮料及其他危害评估及防护

（1）实验室工作区内不得有食物、饮料及存在“手-口”接触可能的其他物质；

（2）实验室工作区内的冰箱禁止存放食物，专用存放食物的冰箱应放置在允许进食、喝水的休息区内。

3. 使用化妆品危害评估及防护

实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆，但允许并建议经常洗手的实验人员使用护手霜。

4. 实验中眼睛和面部的风险评估及防护

（1）处理腐蚀性或毒性物质时，需使用护目镜、面罩或其他保护眼睛和面部的防护用品；

（2）工作人员在实验室的危险区内不要佩戴眼镜，除非同时使用护目镜或面罩；

（3）使用、处理能通过粘膜或皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的情况时，必须佩带护目镜、面罩。

5. 实验中服装和个人防护装备的一般要求

（1）应穿着符合实验室工作需要的服装，工作服应干净、整洁；当工作中有危险喷溅到身上的可能时，应使用一次性塑料围裙或防渗外罩；有时还需要佩戴其他防护装备，如：手套、护目镜、面罩等；

（2）个人防护服应定期更换以保持清洁，遇被危险物品严重污染，则应立即更换；

（3）不得在实验室内设置值班床，严禁在实验室内住宿。

6. 实验中足部防护的一般要求

在工作区，应穿舒适、防滑、并能保护整个脚面的鞋；在有可能发生液体溅溢的工作岗位，可加套一次性防渗漏鞋套；帆布鞋可吸收化学物品和有传染性的液体，最好穿皮革或其他防渗漏的合成材料鞋。

7. 实验中头发和饰物的风险评估及防护

留长发的工作人员应将头发盘在脑后，以防止头发接触到被污染物，并避免人体脱屑落入工作区；头发不得垂肩，应与离心机、切片机等正在运转的机械保持一定距离。

8. 实验中胡须的风险评估及防护

蓄有胡须的男性工作人员必须遵守上项（7）规定。

9. 洗手的要求

实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在进食前都应该洗手；接触血液、体液或其他污染物时，应立即洗手。

10.锐利物品的危害评估及防护

谨慎处理针头、解剖刀和碎玻璃等锐利物品；使用后的针具不要折断、弯曲、破损、重复使用或用手重装在针管上。一次性注射器上的针头、头等锐利物品用后应立即取下放置在专用锐器盒内，在完全装满之前或48小时之内统一进行无害化处理。

11. 工作环境的要求

（1）“清洁”区和“非清洁”区

根据实验室的具体工作情况由主任选择并确定“清洁”和“非清洁”工作区，在清洁区和非清洁区之间设“缓冲室”。被指定为“清洁”的区域，则应努力保持清洁，如采取预防措施，防止电话、视频显示器终端、键盘、门柄及其他经常被手或手上的手套触摸的物品的污染，要求工作人员在触摸设备（如计算机键盘及电话的保护罩等）前取下手套，制定仪器设备和工作面的常规消毒和清洁制度和对严重污染的紧急处理措施办法。

被指定为“非清洁”的区域，允许戴手套接触所有物品（如电话、门柄、计算机终端和其他物品）所有这些物品的表面都认为是不清洁的。未戴手套的人员如果使用该区域内的电话、计算机终端或其他设备，应戴上手套，或在使用后立即彻底洗手。

“清洁”和“非清洁”区都应保持整洁，实验台至少应每天清洁、消毒一次，如有必要可以多次清洗、消毒。在处理溅溢的样品和严重污染的工作台面时，应戴上手套和其他个人防护装备、使用相应合适的清洁剂清除所有的溅溢物。

（2）冰箱、冰柜、水浴锅和离心机应定期清洗和消毒（时间由实验室主任来决定），在发生严重污染后应立即进行清洗和消毒；进行清洗和消毒时应戴上手套，穿上工作服或其他合适的防护服。

（3）外衣：外衣（实验服、工作服）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”和“非清洁”的个人防护服要分开存放。

（4）垃圾处理：每天至少清理垃圾1--2次。

（5）装饰：不得在电灯、灯座或仪器上进行装饰，更不要使用电子装饰物、蜡烛、圣诞树等有引起火灾危害的装饰品。

（6）为便于清洁消毒，实验室内不得有织物装饰的用具或椅子。

（7）个人物品：实验工作区不得存放个人物品，如钱包、手套、皮靴、咖啡杯、运动服、预包装的食品和药品等。

（8）实验室内应配备应急设备，如应急洗眼装备，酒精等消毒用品。

（9）实验室应安装非手触式洗手装置。

（10）实验室内应安装防蚊蝇装置，应定期投撒灭蟑螂老鼠的药物。

（11）用后的废弃物品：实验工作区内的用后废弃物品存量不要太大；具有危险性的液体如酸或碱性液体应专人保管，放在视平线以下；较大的废弃物容器应靠近地面角落存放。

（12）出口通路：实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。

注意：无论任何时间、何种原因都不得阻塞通往灭火器、火警箱、防火沙、安全淋浴或出口的通道。

12. 使用玻璃器具的危害评估及防护

   操作玻璃器具时应遵循以下安全原则：

不要使用破裂或有缺口的玻璃器具

不要用猛力取下玻璃试管上的塞子，粘紧的试管可用刀切开分离，接触过传染性物的玻璃器具，清洗之前应先行消毒；破裂的玻璃器具和玻璃碎片应丢弃在有专门标记的、单独的、不易刺破的容器里；高热操作玻璃器具时应戴隔热手套；在不影响试验质量的前提下，应尽量减少使用玻璃器具。

13. 使用离心机的危害评估及防护

（2）操作：离心机只有在盖好盖板后，才能启动。

（3）传染性物品：所有能够产生气溶胶进行播散的生物制品或标本，均应使用密封的离心管，并在盖紧的离心头或转头中进行。

（4）为防止气溶胶飞溢，应在离心停止30分钟后打开离心物。

（5）清洗：按照消毒隔离制度要求清洗离心机。

（6）平衡：离心时应保持合适的平衡，以保证离心的顺利进行。

14．采集血样的危害评估及防护

（2）工人每天早晨更换消毒液，包括浸泡锐器、止血带的消毒液和手消毒液。

（3）工作人员必须穿工作服，戴好口罩、帽子、和手套。

（4）使用合格的一次性用品，严禁使用包装破损，过效期的用品。

（5）严格执行无菌技术操作规程、静脉采血必须一人一针一管；对每位病人操作前应洗手或手消毒。

（6）无菌物品如棉球需每天更换，开启后使用不得超过24小时。

（7）工作人员需对锐器如采血针采取高度预防措施，用过的采血针需浸泡在含有消毒液的厚壁容器中，集中进行无害化处理。

15. 标本(血清、血浆、全血、尿)在检测过程的危害评估及防护

（2）工作人员要戴口罩、手套进行操作。

（3）废弃的标本连同试管、盖帽要用1000mg /L“84”消毒液浸泡，由工人统一清洁后进行无害化处理。

（4）实验中使用的吸头、一次性塑料杯用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡，由工人统一清洁后进行无害化处理

（5）标本污染物表时，应立即消毒。

（6）离心时，发生试管破裂或标本溅出，由操作者负责用有效消毒剂对离心机内部进行及时消毒处置。

16．微生物分离鉴定药敏试验及基因扩增试验活动的危害评估及防护

（2）实验人员要戴手套、帽子进行操作。当估计会出现微生物和危险物溅出时要戴好眼罩或面罩。

（3）操作中使用的接种环、镊子等金属物品要在酒精灯火焰上烧灼灭菌。

（4）可能产生致病性微生物气溶胶或出现溅出的操作如涂片、接种时，应在生物安全柜内操作，并使用个体防护设备。

（5）实验室内的各种标本、菌种、培养基和其它废弃物在运出实验室前必须灭活（高压、浸泡），需运出实验室灭活的物品必须放在专用的密闭容器中。

（6）操作过程中发生菌种污染物表时，应马上进行物表消毒。

（7）当发生致病性微生物气溶胶污染时，应马上进行人员疏散，通知相关负责人到现场进行指导消毒。

（8）对菌种的保存应严格遵守菌种保存制度，严禁擅自保存各种国家法定传染病菌株或毒株。

（9）实验人员离开实验室前要去除手套，确认无污染或污染已排除，后方可洗手离去。

（10）微生物、PCR实验室要设置纱窗、挡鼠板。

三、特定实验活动危害评估（见以下章节之各种病原体的危害评估）

肝炎病毒的危害评估

肝炎病毒是引起病毒性肝炎的病原体，目前公认的人类肝炎病毒至少有5种类型，包括甲型、乙型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒。甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒主要由消化道传播；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒主要由血源性传播；丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒，必须在嗜肝DNA病毒等辅助下方可复制，故其传播途径与乙型肝炎病毒相同

1、肝炎病毒的分类：

（1）甲型肝炎病毒（HAV）是一种RNA病毒，属微小核糖核酸病毒科，是直径约27nm的球形颗粒，由32个壳微粒组成对称20面体核衣壳，内含线型单股RNA。HAV具有4个主要多肽，即VP1、VP2、VP3、VP4、其中VP1与VP3为构成病毒壳蛋白的主要抗原多肽，诱生中和抗体。HAV在体外抵抗力较强，在-20℃条件下保存数年，其传染性不变，能耐受56℃30分钟的温度及PH3的酸度。

（2）乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae），是直径42nm的球形颗粒。又名Dane颗粒，有外壳和核心两部分。外壳厚7-8nm，有表面抗原（HBsAg），核心直径27nm，含有部分双链，部分单链的环状DNA，DNA聚合酶，核心抗原及e抗原。HBVDNA的基因组约含3200个硷基对。长链的长度固定，有一缺口（nick）此处为DAN聚合酶，短链的长度不等。当HVB复制时，内源性DNA聚合酶修补短链，使之成为完整的双链结构，然后进行转录。HBV DNA的长链有4个开放性读框（ORF），即S区、C区、P区和X区。S区包括前S1前S2和S区基因，编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白；C区以包括前C区，C区基因编码HBcAg蛋白，前C区编码一个信号肽，在组装和分泌病毒颗粒以及在HBeAg的分泌中起重要作用；P基因编码DNA聚合酶；X基因的产物是X蛋白，其功能尚不清楚。HBVDNA的短链不含开放读框，因此不能编码蛋白。

乙型肝炎患者血清在显微镜的观察下可查见3种颗粒：①直径22nm的小球形颗粒；②管状颗粒，长约100～700nm，宽约22nm;③直径为42nm的大球形颗粒。小球形颗粒。小球形颗粒及管状颗粒均为过剩的病毒外壳，含表面抗原，大球形颗粒即病毒颗粒，有实心与空心两种，空心颗粒缺乏核酸。

　　HBV在体外抵抗力很强，紫外线照射，加热60℃四小时及一般浓度的化学消毒剂(如苯酚，硫柳汞等)均不能使之灭活，在干燥或冰冻环境下能生存数月到数年，加热60℃持续十小时，煮沸(100℃)20分钟，高压蒸汽122℃10分钟或过氧乙酸(0.5%)8分钟以上则可以灭活。

　　HBV的抗原复杂，其外壳中有表面抗原，核心成分中有核心抗原和e抗原，感染后可引起机体的免疫反应，产生相应的抗体。

　　A．乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和表面抗体(抗—HBs)HBsAg存在于病毒颗粒的外壳以及小球形颗粒和管状颗粒。于感染后2-12周，丙氨酸转氨酶(ALT)升高前，即可由血内测到，一般持续4～12周，至恢复期消失，但感染持续者可长期存在。HBsAg无感染性而有抗原性，能刺激机体产生抗-HBs。在HBsAg自血中消失后不久或数星期或数月，可自血中测到抗—HBs，抗HBs出现后其滴度逐渐上升，并可持续存在多年。抗-HBs对同型感染具有保护作用。近期感染者所产生的抗-HBs属IgM，而长期存在血中的为抗-HBsIgG。

　　HBsAg有“a”、“b”、“y”、“r”、“w”等多种抗原决定簇，其中“a”是共同的抗原决定簇，“d”、“y”和“r”、“w”为主要的亚型决定簇。HBsAg有8种亚型和2种混合亚型，以adr，adw，ayr，及ayw为主的4种亚型。各亚型的地理分布不同，adr亚型主要分布在亚洲及太平洋地区，adw亚型主要见于北欧，美洲及澳洲，ayw亚型主要在非洲，中东和印度，ayr亚型罕见。在我国的主要是adr亚型，但广西的东北部则主要为adw亚型，，及内蒙则有ayw亚型为主。亚型的测定对流行病学调查，预防研究有一定意义。

乙型肝炎前S抗原及前S抗体

　　前S1及前S2蛋白具有与HBsAg不同的抗原性。完整的HBV颗粒含有S蛋白及前S2蛋白，而缺陷病毒颗粒则无前S2蛋白。血清中出现前S1、前S2抗原是HBV活动性复制的标志。前S2蛋白具有较S蛋白更强的免疫原性，含有前S2蛋白的HBsAg诱生的抗-HBs，其滴度明显高于不含前S2蛋白的HBsAg所诱生者。前S2蛋白具有聚合人血清蛋白白受体（PHSAR）的功能，能使HBV与聚合人血清蛋白结合，以致免疫系统不易识别，且可通过肝细胞膜上的PHSA-R而吸附于肝细胞膜上，从而侵入肝细胞。

B．乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）

　　HBcAg主要存在于受染的肝细胞核内，复制后被释至胞浆中，由胞浆中形成的HBsAg包裹，装配成完整的病毒颗粒后释放入血。血液中一般不能查到游离的HBcAg。血中的Dane颗粒经去垢剂处理后可以查到其核心部分的HBcAg和DNA聚合酶。

抗-HBc，在HBsAg出现后2-5周，临床症状未出现肖，即可由血内测到。早期出现者主要是抗-HBcIgM，以19S五聚体IgM抗-HBc为主，其滴度迅速上升并保持高滴度，至HBsAg消失后，抗-HBcIgM滴度即迅速降低。抗-HBc IgM一般在血内维持6-8个月，是近期感染的重要标志；但在慢性活动型肝炎患者血中亦可测到，主要是7-8S单体IgM抗-HBc。抗-HBcIgG出现较迟，但可长期存在。抗-HBc对HBV感染无保护作用。血清中抗-HBcIgM阳性表明体内有HBV复制，且有肝细胞损害；若抗-HbcIgG阳性且滴度高，伴以抗-HBs阳性，则为乙型肝炎恢复期；若抗-HBcIgG呈低滴度，抗-HBcIgM阴性，而抗-HBs阳性，则是既往感染的标志。

HBVDNA聚合酶存在于Dane颗粒核心内，是一种依赖于DNA的DNA聚合酶，其功能与修补及延伸双链DNA的短链有关。患者血清中HBVDNA聚合酶活性增高常伴有HBV增殖。在急性乙肝的潜伏期内，血清ALT升高之前，血清DNA聚合酶活力即已升高，因此，DNA聚合酶活力测定具有早期诊断意义。急性肝炎患者在发病1个月后若HBVDNA聚合酶活力仍持续升高，是肝炎转为慢性的征兆。

C．乙型肝炎e抗原（HBeAg）和e抗体-（HBe）

　　HBeAg是以隐蔽形式存在HBV核心中的一种可溶性蛋白，其编码基因相互重叠，是HBcAg的亚成分。在感染HBV后，HBeAg可与HBsAg同时或稍后出现于血中，其消失则稍早于HBsAg。HBsAg仅存在于HBsAg阳性者的血液中，通常伴有肝内HBVDNA的复制，血中存在较多Dane颗粒和HBVDNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg阳性是病毒活动性复制的重要指标，传染性高。急性肝炎患者若HBeAg持续阳性10周以上，则易于转为持续感染。

抗-Hbe在HBeAg消失后很短时间内即在血中出现，其出现表示病毒复制已减少，传染降低。但抗-Hbe阳性者的血清中仍可查到少数Dane颗粒，且在患者肝细胞核内可检出整合的HBVDNA片断。抗–Hbe在临床恢复后尚可持续存在1-2年。

（3）丙型肝炎病毒（HCV）是一种具有脂质外壳的RNA病毒，直径50-60nm，其基因组为10kb单链RNA分子。HCV的基因编码区可分为结构区与非结构区两部分，其非结构区易发生变异。HCV与HBV及HDV无同源性，可能是黄病毒属中分化出来的一种新病毒。本病毒经加热100℃10分钟或60℃10小时或甲醛1:100037℃96小时可灭活。HCV细胞培养尚未成功，但HCV克隆已获成功。HCV感染者血中的HCV浓度极低，抗体反应弱而晚，血清抗-HCV在感染后平均18周阳转，至肝功能恢复正常时消退，而慢性患者抗-HCV可持续多年。

（4）丁型肝炎病毒(HDV) 是一种缺陷的嗜肝单链RNA病毒，需要HBV的辅助才能进行复制，因此HDV现HBV同时或重叠感染。HDV是直径35-37nm的小园球状颗粒，其外壳为HBsAg，内部由HDAg和一个1.7kb的RNA分子组成。HDAg具有较好的抗原特异性。感染HDV后，血液中可出现抗-HD。急性患者中抗-HDIgM一过性升高，以19S型占优势，仅持续10-20天，无继发性抗-HDIgG产生；而在慢性患者中抗–HDIgM升高多为持续性，以7-8型占优势，并有高滴度的抗–HDIgG。急性患者若抗-HDIgM持续存在予示丁型肝炎的慢性化，且表明HDAg仍在肝内合成。前已知HDV只有一个血清型。HDV有高度的传染性，及很强的致病力。HDV感染可直接造成肝细胞损害，实验动物中黑猩猩和美洲旱獭可受染，我国已建立东方旱獭HDV感染实验动物模型。

（5）戊型肝炎病毒（HEV）为直径27-34nm的小RNA病毒。在氯化铯中不稳定，在蔗糖梯度中的沉降系数为183S。HDV对氯仿敏感，在4℃或—20℃下易被破坏，在镁或锰离子存在下可保持其完整性，在硷性环境中较稳定。HDV存在于替伏末期及发病初期的患者粪便中。实验动物中恒河猴易感，国产猕猴感染已获成功

2、安全保障措施

(1)、个人防护

A 高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、生病都会增加感染的危险性。皮肤的伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。

B 进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。

C 进入实验室应戴手套。如果接触物传染危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。

D 离开实验室前必须脱去隔离衣并洗手。

E 严禁在实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。

F 减少实验室内利器的使用。

(2)、带入和带出实验室的物品

A 对所有带入实验室的物品都应进行检查,含有测试样品的包裹应在安全柜或其他适当的装置内打开。

B 将测试样品转送其他实验室时，应防止对人员和环境的污染。护送样品的人应明确接收地点和接收人，实验室相关人员应及时确认样品已送达指定的实验室，被转入安全位置并得到妥善处理。

C 污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒。

3、消毒方法

A  废弃物缸：10%（V/V）次氯酸钠（含10，000ppm有效氯）。

B  生物安全柜工作台面和仪器表面：70%乙醇。

C  溢出物：10%次氯酸钠（V/V）。

D  污染的台面和器具：40%甲醛水溶液，或过氧化氢、过氧乙酸。

四、工作人员素质

本实验室共有技术人员15名，其中博士3名，硕士9名，学士3名，2名曾经从事微生物学专业，5名曾通过生物安全培训并经考核成绩合格，所有技术人员均通过科室生物安全培训，上岗前经院方体检无现患严重疾病，无其他患传染性疾病，健康状态良好。

五、评估结论

本次评估实验室共16项可能潜在危险的实验活动，在实验操作实验施过程中在无控制措施情况下可能产生的高危害度5项，中度11项，低度0项；对危害发生的可能性分析，实验危害较大可能发生的有0项，可能发生5项，较少可能发生11项；这些危害造成高度严重后果的5项，后果严重性中度的11项，后果严重性低度的0项。根据拟采取的预防控制措施后依然存在的残留风险为高度0项，中度0项，低度危害16项。

                  西安交通大学第二附属医院科研中心实验室

                                    2015-11-11