普通染色方法在神经研究中的应用

普通的染色方法在病理学中应用广泛，不失为常规观察细胞结构的良好的技术（如果大家不是看某一蛋白或者受体分布的话），虽说常见的是应用在冰冻或者石蜡切片中，逐渐在考虑应用在培养的细胞中，比如 ，H-E染色用于观察细胞凋亡，南通医学院介绍的周围神经三色染色法用于背根神经节培养 ，高尔基染色用于神经纤维的显示等等，价格低廉、省时省力，如果灵活运用，结合免疫组化和免疫荧光，不失为好的研究手段。

由于知识有限，希望广采博收，大家平时知道的染色方法，可以在此谈一下，互惠互利，作为实验初期的实验方法，冰冻、石蜡、培养细胞的均可，只要是神经相关的。

常规的步骤略些，特殊的步骤详些，注意事项强调一下。 

改良三色法显示石蜡切片中的神经轴突及神经髓鞘

1．实验标本：(])人体检材：正常人体脑干组织及脊神经根‘(2)动物标本：正常硼5b大白鼠脑干组织及股神经c所有标本均经10％福马林固定20小时，常规石蜡包埋，切片厚5um。 

2．试剂配制：(1)harris苏木素：将O．5g苏木素精加入5m1无水乙醇中溶解，将10g硫酸铝钾加入100 m1双蒸水中溶解，将两种溶液混匀后加热至沸．即加入0．25g黄色氧化汞。待溶解后在冰水中冷却。过滤后加入5m1冰醋醋。该染液可在室温保存1个月左右，若保存时间过长应适当延长染色时间。(2)三色液：将O．3g固绿FCF，O．6g变色素2R及0．6g磷钨酸依次加入100 m1双蒸水中溶解，再加入1m1冰醋酸，调节pH值至3．4。该染液可在室温保存两周，若保存时间过长或PH值发生改变，则染色偏紫。绿色变浅。(3)o．3％冰醋酿溶液，在临用前配制. 

3．染色方法：(])切片常规脱蜡至水(2)harris苏木素液染5分钟；(3)双蒸水冲洗5分钟；〔4)三色液染30分钟；(5)0．3％冰醋酸冲洗2次，每次5秒钟；流水冲洗5—10分钟。至切片组织不脱色为止；(7)脱水、透明、中性树胶封片。

参考：邓平，中华病理学 1998

用于培养的背根神经节步骤相似。 

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=46&id=821097&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#821097

为研究周围神经髓鞘被覆状态，我们经常要进行髓鞘染色

或许研究神经轴突髓鞘化的战友可以把细胞培养在盖玻片上试一试。

附件：提到了其他的一些染髓鞘的方法以及染神经元的浸银法，如果哪位战友试验过在培养的细胞中应用，请来此介绍一下，汇编成册，以算是功德一件。来源于病理版 

锇酸 osmic acid 染色 周围神经横切面，具体方法不知道 

固定:4%甲醛液固定,冷冻切片,厚20~30微米;

试剂配制: (1)银水溶液100ml,吡啶8滴,95%乙醇5ml;(2)对苯二酚甲醛还原液:对苯二酚0.3g,蒸馏水70ml,4%甲醛液20ml,丙酮10ml.

操作:

(1) 冷冻切片,厚20~30微米,蒸馏水充分清洗;

(2) 室温下,用银溶液浸染6~12小时,若37度下,则浸染2~5小时(切片呈浅棕色);

(3) 95%乙醇速洗2次;

(4) 对苯二酚甲醛还原液1~3min;

(5) 蒸馏水洗2min;

( 6 ) 0.2%氯化金水溶液调色5~10min;

(7) 蒸馏水稍洗;

( 8 ) 5%硫代硫酸钠固定3min;

(9) 蒸馏水洗2次;

(10) 将切片组织浸于50%乙醇内,裱于载物片上,用滤纸稍吸干;

(11) 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固.

结果:神经元,神经纤维呈棕至黑色;无髓鞘轴突亦染色,背景紫灰色

shows that neuron cell bodies (Perik) and processes contain cytoskeletal elements termed neurotubules and neurofilaments (NF). So numerous are these elements that so-called neurofibrils can be seen by light microscopy after nervous tissue has been impregnated with silver salts. Find the cell bodies of the large motor neurons in this slide of spinal cord stained by silver impregnation. Identify the neurofibrils which are located in the perikaryon and extend out into the dendrites (Den) and the larger axons。

40倍光镜，脊髓，运动神经元，显示神经元胞体和突起中的细胞骨架－称为神经管和神经丝。

silver impregnation 

银浸染色在Alzheimer Disease中的应用。

图一（上）：Neurofibrillary Degeneration神经原纤维退变；

图二（中）：both alteration;

图三 （下 ）：Senile plaques 老年斑

（下左）：Senile plaques 低倍

（下右）：Senile plaques 中等

来源：http://www.neuropat.dote.hu/alzheim.htm 

http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2480166_0.html TTC染色的大鼠脑片wgh_soly 战友处

http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2512510_0.html 同上－为steven668 战友所有

1. 关于TTC浓度的问题。大多文献都说2%。我也用过2%的浓度。看看上面的图片就知道了。红的地方发黑，白的地方发红。请看看印度人写的一篇关于TTC浓度的文章 (Joshi CN, Jain SK, Murthy PS. An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts. Brain Res Brain Res Protoc. 2004 Apr;13(1):11-7.) 。我看了这篇文章，就把浓度改为0.1%。.效果很好，没有上面的情况，这个浓度敏感度高，红白分界清晰，红色是红色，白色是白色。也明显减少了TTC得用量，何乐而不为呢？ 

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skyskytotop edited on 2005-08-20 17:17 举报 

细胞核染料

1.苏木精（hematoxylin) 细胞核染料，易溶于无水酒精、甘油和热水中。其本身不是染料，不能直接染色，必须先氧化成苏木红并使其成熟，配合适当的媒染剂增加亲和力后，才有染色作用。常用的媒染剂有：硫酸铝铵（铵矾）、钾明矾以及铁明矾。氧化剂有：氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢。如果不急等染色用，可在日光中自然成熟后再用。自然成熟的染色液配制时间愈长染色效果愈强、愈好。组织被染色后保存时间长、不易退色，颜色鲜艳，应用广泛。是染细胞核的首选染色剂。

除染细胞核外，还可以染软骨、线粒体、神经胶质纤维等。

染细胞核时，最初为紫红色或者深砖红色，在碱性溶液中反蓝，为鲜艳的蓝色或深蓝色。注意在酸性溶液中容易被脱色。染色过程常常用0.1％－－0.3％的酸性水溶液或者酸性酒精作为分色剂；不能染色时间太长，容易过染（背景变深，不该着色的部位也着色）。

2.甲苯胺蓝－O（yoluidine bule o）碱性染料，硫堇的代替品，溶于水，因此常用1%的水溶液。

染细胞核、黏液、软骨基质‘肥大细胞颗粒、尼氏小体，细胞核蓝色、其他为蓝紫色。在组织化学染色中，测定胸腺核苷酸。

3.亚甲蓝（美蓝，methylene blue) 碱性染料，蓝色粉末。溶于水，不溶于酒精。是一种重要的细胞核染料。还可以用于染细菌、神经组织、浆细胞、尼氏小体、嗜碱性颗粒、肥大细胞、血液等，其优点是不会过染。有异染性，组织被然成蓝色。

细胞质染料

1.伊红－Y,伊红－B（曙红Y，eosin Y,eosin B）酸性染料，均能溶于水和酒精，不溶于二甲苯，为最长用的细胞质染色剂。纯品为红中带蓝色的 结晶或棕色粉末。水溶液浓度高时为暗紫色，低时为红黄色，有黄绿色荧光；酒精溶液浓度高时为红黄色，低时为红色。细胞质染色为鲜艳的红色。配置时加微量的酸(几滴）后，染色更加漂亮。在低度酒精中容易脱色，在其内不能久置。长与苏木精、甲基绿做对比染色。颜色鲜艳、保存持久。

2.快绿（坚牢绿 ，fast green,FCF)酸性 染料，能溶于水和酒精。长配成1％的无水酒精溶液使用。可与番红O做对比染色，还可以与番红O、甲基紫、橙黄G做四重染色。此染色剂色彩鲜艳，不易退色，即使将染好的组织切片直接置于阳光的照射下，亮丽的绿色仍能保持数月之久，故此有坚固绿之称。

3.苦味酸（picric acid)：为黄色结晶，强酸性，水中饱和度为0.9％－1.2％。在空气中可自行燃烧，所以常常以在水中饱和形式保存。常用来配制固定液及对比染色剂，染细胞质，在Van Gieson 结缔组织染色法中与酸性复红做对比染色。

细胞质、肌组织被染成黄色。

4.橙黄G （orange G）酸性染料，能溶于酒精、丁香油，也能溶于水。常常与龙胆紫等合并染胰岛的细胞。作为苏木精的衬染，染细胞质，参与Mallory三色法对比染色结缔组织。黄色。优点是不容易过染。

5.甲基蓝（methy blue）强酸性染料，能在酒精和水中溶解。既是一种重要的细胞质染料，也是一种良好的对比染色剂，水溶液还可以作为原生动物的活体染料。被染组织为蓝色。该染料容易在水中脱色，也极易氧化，因此染色不能保持太久为其最大缺点。

6.酸性品（复）红（acid fuchsin) 酸性染料， 为碱性品红的磺化衍生物，红色粉末。染细胞质、红细胞、角化上皮、线粒体等为鲜艳的红色。多用于Van Gieson 法和Mallory三色法染肌纤维，与苦味酸合用鉴别平滑肌和结缔组织。