| ELISA实验步骤一览表 | ||||
| 间接法（测抗体） | 双抗体夹心法（测抗原） | 竞争法（测抗原） | 抑制性测定法 | |
| 1 | 包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱 | 包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱 | 包被特异性抗体： 同左 | 包被抗原： 同左 |
| 2 | 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 3 | 加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时 | 每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。 | 分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）。 | a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml，37℃作用1～2小时。 |
| 4 | 洗涤：重复2 | 同左 | 洗涤：同左 | 洗涤 |
| 5 | 加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml。37℃作用1～2小时 | 加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。 | —— | 各加入0.2ml抗参考抗体的酶结合物37℃作用1～2小时。 |
| 6 | 洗涤：重复2 | 同左 | —— | 洗涤 |
| 7 | 加入0.2ml底物溶液于每个凹孔,(O.P.D或O.T)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂）。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 8 | 加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 9 | 观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。 | 同左 | 用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数。 | 同左 |
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