2015版药典内毒素检测SOP

规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。

2 范围

适用于本公司质管部对注射用水的细菌内毒素检验。

3 责任

检验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。

4 内容

本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

4.1仪器、用具

4.1.1天平、电热干燥箱、旋涡混合器、恒温水浴锅、反应试管、镊子（金属）、金属盒、移液器具，酒精灯、脱脂棉球、剪刀、砂轮、封口膜，记号笔。

4.1.2用具除去外源性内毒素：

将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。

4.2试剂

4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

4.2.2鲎试剂

4.3鲎试剂灵敏度复核试验  

鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。

λc=lg-1(∑X/4)

式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ≤λc≤2.0λ时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。

4.4供试品干扰试验

按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的细菌内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水制成的每一浓度平行做2支和用供试品溶液或稀释液制成的每一浓度平行做2支和用供试品溶液或其稀释液制成的每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液各做2支阴性对照管。

注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

可通过对供试品进行最大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排出干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排出干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

凝胶限度试验

供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：

MVD =C* L/λ

式中 λ为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）

L为供试品的细菌内毒素限值。

     C为供试品溶液的浓度

供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数不超过MVD。

加样：取鲎试剂8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支为样品管，加入样品液0.1ml；2支加入阴性对照管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液。

（37±1）℃试管恒温仪或水浴中保温（60±2）min。

结果判断：

阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，样品阳性对照为阳性，试验结果成立。

2支样品管均为阴性时，样品符合规定；

2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；

样品管1支为阳性1支为阴性时，需复试。

复试时做4支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。

    含2λ内毒素标准品的供试品溶液的制备:取样品溶液1.0ml+0.5EU/ml的内毒素标准品溶液1.0ml混合。

结果判断：恒温结束后取出试管或反应瓶缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不能保持完全即使有部分脱落者也判为阴性。