叶绿素的测定(分光光度法)

叶绿素的测定

    （分光光度法）

ＳＬ88—1994

Determination of chlorophyII

（Spectrophotometric method）

水利部1995／05／01批准1995／05／01实施

1 总则

1.1 主题内容

本标准规定了用分光光度法测定水体中的叶绿素。

1.2 适用范围

本标准适用于河流、湖泊、水库或池塘等水体中叶绿素的测定。

1.3 干扰及消除

1.3.1 脱镁叶绿素ａ能够干扰叶绿素ａ的测定，当含有脱镁叶绿素时叶绿素ａ的测定值偏高。因此，在测定叶绿素ａ的时候，还要测定脱镁叶绿素ａ

1.3.2 脱镁叶绿素ａ对叶绿素ａ的干扰，可通过测定叶绿素ａ酸化前后产生的吸收峰之比，对表观叶绿素ａ的浓度作脱镁叶绿素ａ的校正。

2 原理

将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%的丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、5、630ｎｍ的吸光度，计算叶绿素的浓度。

3 仪器

3.1　分光光度计。

3.2　比色池：10ｍｍ和50ｍｍ。

3.3　医用离心机。

3.4　离心管：10～15ｍＬ带塞刻度管。

3.5　研钵：直径约80ｍｍ。

3.6　过滤装置：过滤器，微孔滤膜（孔径0.45μｍ，直径60ｍｍ），真空泵（吸气泵或蠕动泵）。

3.7 常用实验设备。

4 试剂

4.1 碳酸镁悬浮液：1%（ｍ／Ｖ）。称取1.0ｇ细粉末碳酸镁（ＭｇＣＯ3）悬浮于100ｍＬ蒸馏水中。每次使用时，要充分摇匀。

4.2 丙酮溶液：90%（ｖ／Ｖ）。在900ｍＬ丙酮中加100ｍＬ蒸馏水。

4.3 盐酸溶液：1ｍｏｌ／Ｌ。量取83ｍＬ盐酸（ρ＝1.19ｇ／ｍＬ）溶于水中，冷却并稀释至1000ｍＬ。

5 样品的采集与保存

5.1 样品应按浮游植物定量采样方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、湖泊、水库取500ｍＬ，池塘取300ｍＬ。

5.2 采样后，样品应放在荫凉处，避免日光直射，最好立即对水样进行分析处理。如需放置水样，则应避光冷藏保存（2～5℃），而且每升水样需加1ｍＬ1%碳酸镁悬浮液，以防止酸化引起色素溶解。

6 步骤

6.1 浓缩：在一定量的试样中添加0.2ｍＬ碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60ｍｍ的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。

6.2 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3ｍＬ丙酮溶液（4.2）至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过6ｍＬ，盖上管塞，置于4℃的暗处浸泡24ｈ。

6.3 离心：将离心管放入离心机中，以4000ｒ／ｍｉｎ速度离心分离20ｍｉｎ。将上清液移入标定过的10ｍＬ具塞刻度管中，加少量90%丙酮溶液于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2～3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10ｍＬ。

6.4 测定：取上清液于10ｍｍ或50ｍｍ的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读取波长750，663，5和630ｎｍ的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释度，使其光密度ＯＤ663大于0.2，小于1.0。

7 结果表示

从各波长的吸光度中减去波长750ｎｍ的吸光度，作为已校正过的吸光度Ｄ，按下式计算叶绿素的浓度：

8 注意事项

8.1 使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤。

8.2  750ｎｍ处的吸光度读数用来校正混浊度。由于在750ｎｍ的提取液的吸光度对丙酮与水之比的变化非常敏感，因此对于丙酮提取液的配制要严格遵守90份丙酮比10份水（体积比）的配比。

8.3 使用斜头离心机时，容易产生二次悬浮沉淀物。为了减少这一困难，使用外旋式离心机头，在离心之前瞬间加入过量的碳酸镁。

8.4 在研钵中用90%丙酮溶液提取叶绿素时，如果研磨操作进行不充分，就不能完全提取出来。也可以用外筒玻璃代替研钵，研棒用特氟隆制的匀化器。

8.5 因为叶绿素提取液对光敏感，故提取操作等要尽量在微弱的光照下进行。

8.6 吸收池事先要用90%丙酮溶液进行池校正。

8.7  750ｎｍ的吸光度是检查90%的丙酮溶液浊度的。用10ｍｍ吸收池，750ｎｍ的吸光度在0.005以上时，应将溶液再一次充分地离心分离，然后再测定其吸光度。